牛奶中碳、氮、氢和氧稳定同位素比的测定及其在产地溯源分析中的应用

侯建波，张晓峰，朱晓雨，谢 文，张明哲，邓晓军，韩 芳，史颖珠，祝泽龙

(1.浙江省检验检疫科学技术研究院，杭州 310016；2.浙江出入境检验检疫局技术中心，杭州 310016；3.上海市检验检疫科学技术研究院，上海 200003；4.安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心，合肥 230032)

牛奶具有营养丰富、容易消化吸收、物美价廉、食用方便等特点，备受消费者喜爱。随着人民生活水平的提高，对牛奶的消费需求不断增长，同时对牛奶的质量要求越来越高。随着我国进出口贸易的蓬勃发展，食品贸易已经呈现全球化趋势，进口产品已成为国内消费者日常选择的对象。目前市场中牛奶的销售价格参差不齐，相同类型和规格的牛奶，由于产地的不同可能会带来几倍甚至几十倍的价格差异，因此追溯牛奶产地的真实性对确定其价值具有非常重要的意义。

欧盟早在1992 年就已提出产地的概念，并在2000年要求在食品的生产、加工和流通等环节建立溯源制度，明确产品来源[1-3]；美国、日本等国家也相继建立可追溯体系；我国《食品安全法》明确规定食品生产经营者应当依法建立食品安全追溯体系，保证食品的可追溯性。由于生物的同位素指纹与其生长方式、生长环境密切相关，稳定同位素溯源技术已成为追溯食品来源和实施产地保护的一种有效工具。该技术已成功应用于肉制品[4-8]、葡萄酒[9-11]、谷物[12-13]、茶叶[14]、蜂蜜[15]、果汁[16-17]、乳制品[18-21]等食用农产品和食品的产地溯源研究中。已有人通过采用元素分析仪等设备串联同位素质谱仪测定牛奶样品或其所含蛋白质、氨基酸中的碳、氮、氢、氧、硫和锶等稳定同位素比值来对牛奶的产地进行溯源研究和及其产地归属情况进行分析[22-26]。还有研究人员通过红外光谱法[27]、指纹图谱法[28]、射频识别技术[29]和微生物群落分析[30-31]等方法，对牛奶产地溯源开展研究。

本工作通过元素分析-同位素质谱仪(EAIRMS)测定牛奶的碳、氮稳定同位素比值(δ13C 和δ15N)，多用途气体制备-连续流稳定同位素质谱仪(GasBench-IRMS)测定牛奶中水的氢、氧稳定同位素比值(δ2H 和δ18O)。以牛奶的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O 等4个指标为分析对象，同时对澳大利亚、奥地利、德国、西班牙、新西兰、意大利和中国的牛奶样品进行测试和统计比对，并对其判别牛奶产地溯源的可行性进行分析，提出了判别模型。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Flash型2000 型元素分析仪；Delta/Mat 252 GasBench II型多用途气体制备仪；Delta V Advantage型稳定同位素质谱仪；2.5 Triad 型冷冻干燥机；CPA225D 型分析天平；锡杯(9 mm×5 mm)。

铂(Pt)催化剂；氦气(He)和CO2的纯度不小于99.999%；O2的纯度不小于99.999%；N2的纯度不小于99.999%；H2的纯度不小于99.999%；H2/He混合气中H2的体积分数为1.99%；CO2/He混合气中CO2的体积分数为0.301%。

咖啡 因(IAEA-600):δ13C＝－27.771‰ ±0.043‰(相对标准为VPDB)。

L-谷氨 酸(USGS40):δ13C＝－26.39‰ ±0.04‰(相对于VPDB-LSVEC)，δ15N＝－4.52±0.06‰(相对于空气中的N2)。

甘氨酸(USGS65):δ13C＝－20.29±0.04‰(相对标准为VPDB-LSVEC)，δ15N＝20.68±0.06‰(相对于空气中的N2)。

水(USGS45):δ2H＝－10.3±0.4‰(相对标准为VSMOW-SLAP)，δ18O＝－2.238±0.011‰(相对标准为VSMOW-SLAP)。

水(USGS47):δ2H＝－150.2±0.5‰(相对标准为VSMOW-SLAP)，δ18O＝－19.80±0.02‰(相对标准为VSMOW-SLAP)。

水(USGS50):δ2H＝32.8±0.4‰(相对标准为VSMOW-SLAP)，δ18O＝4.95±0.02‰(相对标准为VSMOW-SLAP)。

咖啡因(IAEA-600)、L-谷氨酸(USGS40)、甘氨酸(USGS65)、水(USGS45)、水(USGS47)、水(USGS50)均为参考气校准物质和质量控制样品。

采集的牛奶样品主要有澳大利亚牛奶样品35个(12个品牌)；奥地利牛奶样品5 个(1 个品牌)；德国牛奶样品9个(3个品牌)；西班牙牛奶样品4个(1个品牌)；新西兰牛奶样品13个(4 个品牌)；意大利牛奶样品7个(2个品牌)；中国牛奶样品10个(8个品牌)。

1.2 仪器工作条件

1)元素分析仪(δ13C 和δ15N 的测定) He载气流量200 mL·min－1，CO2参考气流量90 mL·min－1，O2流量180 mL·min－1；氧化炉温度960 ℃，还原炉温度640 ℃，水阱温度50 ℃。

2)GasBench(δ2H 和δ18O 的测定) H2/He或CO2/He混合气流量100 mL·min－1，He载气流量0.5 mL·min－1；每个样品吹扫5 min；气相色谱(GC)色谱柱恒温50 ℃，进样盘温度25 ℃。

3)同位素质谱仪 电子轰击离子源(EI)，离子源电压3.06 kV；真空度1.2×10－4Pa；电流1.5 mA；δ13C、δ15N 和δ18O 的连续测定精度小于0.06‰(n＝10)；δ2H 的连续测定精度小于0.4‰(n＝10)。

1.3 试验方法

1.3.1δ13C和δ15N 的测定

取2μL牛奶样品置于锡杯中，密封，通过自动进样器进入元素分析仪，按照相应仪器工作条件进行δ13C的测定。

将牛奶进行冷冻干燥成粉末，研磨均匀，取干粉0.8 mg置于锡杯中，密封，通过自动进样器进入元素分析仪，按照相应仪器工作条件进行δ15N 的测定。

1.3.2δ2H 的测定

取混匀的牛奶500μL 至12 mL 样品瓶中，加入Pt催化剂，密封，样品瓶放入自动进样器，将H2/He混合气通过吹扫模式充满样品瓶，赶出瓶内空气。样品瓶密封静止平衡60 min，使得样品瓶中混合气的2H/1H 与牛奶水中的2H/1H 达到同位素平衡。顶空进样，按照相应仪器工作条件进行测定。

1.3.3δ18O 的测定

取混匀的牛奶500μL 至12 mL 样品瓶中，密封后将样品瓶置于自动进样器，将CO2/He混合气通过吹扫模式充入样品瓶赶走瓶内空气。样品瓶密封静止平衡18 h，使混合气CO2的18O/16O 与牛奶水中的18O/16O 达到同位素平衡状态。顶空进样，按照相应仪器工作条件进行测定。

1.3.4 计算方法

平行测试结果取平均值，每5个样品穿插一个标准品进行质量控制。各元素的稳定同位素比计算公式如下:

式中:δ为稳定同位素比，‰；R样品和R标准分别为样品和标准品中各元素的重同位素和轻同位素的丰度比，即13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O。其中δ13C的相对标准为VPDB 和VPDB-LSVEC，δ15N的相对标准为空气中的N2，δ2H 和δ18O 的相对标准为VSMOW-SLAP。

1.3.5 数据处理

采用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析、Duncan 多重比较分析、聚类分析和判别分析。其中，聚类分析采用系统聚类，聚类距离为欧式距离，聚类方法采用组间联接聚类法。判别分析采用Fisher线性判别分析。

2 结果与讨论

2.1 稳定同位素的谱图

按照试验方法对标准品样品进行测试，δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 谱图见图1。

图1 碳、氮、氢、氧的稳定同位素谱图Fig.1 Spectra ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O

2.2 碳、氮、氢、氧稳定同位素测试结果的地域间差异分析

按照试验方法对澳大利亚、奥地利、德国、西班牙、新西兰、意大利和中国等7个不同国家的牛奶中碳、氮、氢、氧稳定同位素进行检测，结果见图2。对测试结果进行了方差分析，结果见表1。其中，表1中数值为平均值±标准偏差，A、B、C、D 表示存在极显著性差异(p＜0.01)[32]；a、b、c、d表示存在显著性差异(p＜0.05)[5]。

由图2和表1可知:对δ13C的测试结果按从大到小的国家顺序依次为中国/意大利、西班牙、德国、澳大利亚/奥地利/新西兰。研究表明，δ13C 可能与奶牛的饲养方式及牧草类型有关。不同类型植物δ13C差异较大，其中C4植物的δ13C为－12.92‰～－14.38‰，明显高于C3植物的δ13C(－24.25‰～－31.71‰)，牧草既有C3植物也有C4植物[32]。因此，不同国家牛奶中δ13C 的差异，可以反映出奶牛在饲养中使用的牧草类型和饲养方式的差异，如果饲养过程中以C3植物类牧草为主，则其δ13C偏小，以C4植物类牧草为主或引入玉米秆等辅料，则其δ13C含量偏大。

图2 不同国家牛奶样品的δ13 C、δ15 N、δ2 H 和δ18 O 分析结果Fig.2 Analytical results ofδ13 C、δ15 N、δ2 H andδ18 O in milk samples from different countries

表1 不同国家牛奶样品的碳、氮、氢、氧稳定同位素方差分析结果Tab.1 Results of variance analysis ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O in milk samples from different countries

对δ15N 的测试结果按从大到小的国家顺序依次为澳大利亚、新西兰、德国、意大利/奥地利/西班牙、中国。进口牛奶中δ15N高于国产牛奶。研究表明，δ15N 不但与饲料有关，还受到地域环境、气候、土壤状况以及生产方式和动物自身代谢的影响。因此不同地域牛奶中δ15N 会存在一定的差异。

对δ2H 的测试结果按从大到小的因家顺序依次为澳大利亚、新西兰、西班牙、德国、意大利、奥地利、中国。δ2H 测试结果和标准差均较大，说明牛奶的δ2H 在地域间存在较大的差异。由于氢稳定同位素组成与当地饮用水密切相关，因此，可将其作为地域信息的载体用于产地来源的分析。

对δ18O 的测试结果按从大到小的国家顺序依次为澳大利亚、新西兰、西班牙、德国、意大利、奥地利、中国，δ18O 与δ2H 的地域排序顺序基本一致。对δ2H 和δ18O 进行相关性分析，见图3。

由图3 可知:δ2H 和δ18O 存在一定的正相关性，所得线性回归方程为y＝7.097x－0.113 3，相关系数为0.842 2。但由于不同地域牛奶中δ2H的测试结果差异更明显，因此试验选择δ2H 反映地域差异的效果会更显著。

图3 牛奶样品中δ2 H 和δ18 O 的相关性Fig.3 Correlationship betweenδ2 H andδ18 O in milk sample

2.3 碳、氮、氢、氧稳定同位素测试结果的聚类分析

通过聚类分析，可以初步判断不同地域牛奶中碳、氮、氢、氧测试结果的地域差异及分类效果，结果见图4。其中，横坐标A、B、C、D、E、F、G 分别代表德国、西班牙、意大利、澳大利亚、新西兰、中国、奥地利。

图4 牛奶δ13 C、δ15 N、δ2 H 和δ18 O 系统聚类树形图Fig.4 Dendrogram of clustering analysis with values ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O

由图4所示，在纵坐标3.50处用实线将树形图切断，可将牛奶样品分为4类，第1类和第2类主要为澳大利亚和新西兰的牛奶，其中也包含了少量西班牙的牛奶；第3类主要为德国和意大利的牛奶；第四类主要为中国和奥地利的牛奶，其中包含了1个意大利的牛奶。

通过对稳定同位素测定结果的聚类分析，可以对牛奶样品进行一定的分类和区分，可作为牛奶产地判别的参考指标。

2.4 碳、氮、氧、氢稳定同位素指标对牛奶产地的判别分析

为了进一步确定牛奶产地的判别效果，了解各个指标在牛奶产地分析中的作用，试验采用Fisher线性判别方法对碳、氮、氢、氧稳定同位素测试结果等4个指标的判别能力进行比较，判别模型的可靠性采用交叉检验法(留一法)进行检验[8]，结果见表2。

表2 不同国家牛奶中碳、氮、氢、氧4种元素稳定同位素比值测试结果的线性判别分析的交叉验证结果Tab.2 Results of cross validation test on testing results of linear discriminant analysis on values ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O in milk samples from various countries

由表2可以看出:在区分牛奶地域来源时，单一指标的判别效果较弱，交叉检验的整体判别正确率低于60%，其中δ2H 指标的判别效果略优于其他指标。将测试结果进行组合后，判别正确率明显提升，δ13C、δ15N 和δ2H 等3项指标组合交叉检验整体判别正确率达到84.3%，其中澳大利亚和新西兰存在相互误判的情况。由于δ2H 和δ18O 存在一定的相关性，在引入δ18O 后，整体判别正确率并未提升，因此可采用δ13C、δ15N 和δ2H 组合指标对牛奶产地进行判别分析。

对δ13C、δ15N 和δ2H 组合指标进行判别函数和方差贡献率分析。根据SPSS软件给出的数据，判别函数1方差贡献率88.8%，同时包含了δ13C、δ15N 和δ2H 的信息；判别函数2 的方差贡献率8.1%，主要包含δ13C 和δ2H 的信息。判别函数3的方差贡献率3.1%，主要包含δ15N 的信息。因此推测δ13C、δ2H 是牛奶产地判别的主要参考指标，其次是δ15N。当采用δ13C、δ15N 和δ2H 组合指标对不同国家牛奶样品进行区分时发现，除了德国和意大利存在部分牛奶重叠的情况、澳大利亚和新西兰的牛奶产地区分效果略差等问题，组合指标可以对不同国家的牛奶进行区分。利用牛奶中δ13C、δ15N和δ2H 组合指标建立的判别模型依次是Y(澳大利亚)＝261.78－13.82δ13C＋25.72δ15N－0.38δ2H、Y(奥地利)＝－250.32－14.53δ13C＋22.07δ15N－0.28δ2H、Y(德国)＝－194.36－11.72δ13C＋21.80δ15N－0.07δ2H、Y(新西兰)＝－273.18－14.54δ13C＋24.16δ15N－0.29δ2H、Y(西班牙)＝－159.48－10.91δ13C＋19.25δ15N－0.17δ2H、Y(意大利)＝－165.70－10.56δ13C＋20.22δ15N－0.20δ2H 和Y(中国)＝－130.69－9.45δ13C＋13.59δ15N－0.48δ2H。

对来自不同地区的盲样进行鉴别归类时，可将各样品的测定结果分别代入上述判别模型，比较各地域Y值大小，并将盲样归属于Y值最大的地域。

本工作通过元素分析-同位素质谱法和多用途气体制备-连续流稳定同位素质谱分析法，分别对澳大利亚、奥地利、德国、西班牙、新西兰、意大利和中国等7个地域牛奶的碳、氮、氢、氧稳定同位素指标进行测试，并对测定指标进行方差分析、聚类分析和判别分析。结果表明:碳、氮、氢稳定同位素组合指标对牛奶地域的整体判别正确率较高(84.3%)，对于牛奶的产地溯源分析可以提供一些必要的信息，可作为牛奶产地溯源的有效参考指标，对牛奶产地的监管具有一定的意义。后续研究可通过增加元素分析或红外光谱等其他参数和技术手段进行测定和分析，进一步提高牛奶产品地域的判别正确率。