MMP-9在RSV毛细支气管炎与哮喘患儿中的作用研究

曹中兵，何仁忠，李开为

(1.湖北理工学院 a.医学院，b.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435003；2.鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院) 儿科，湖北 黄石435000)

呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎是婴幼儿下呼吸道最常见的呼吸道疾病之一，部分患儿日后可发展成为哮喘，其发病机制目前尚不完全清楚。研究表明：RSV毛细支气管炎的气道炎症是一个复杂过程，由多种炎症细胞及结构细胞(上皮细胞等)共同参与，其炎症细胞、上皮细胞及其分泌的炎性因子在其中起到非常重要的作用[1-2]；且已有研究证实中性粒细胞及其释放的炎性因子介导的炎症反应，在毛细支气管炎的发生发展过程中也起着非常重要的作用[3]。MMP-9是属于基质金属蛋白酶(Matrix metalloproleinases,MMPs)家族中的一种被糖化的明胶酶，主要来源于炎性细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞)。有研究表明，MMP-9参与气道的炎症反应，认为与支气管哮喘的气道炎症反应有关[4]。同时有学者认为有1/3及以上的RSV毛细支气管炎患儿可发展成支气管哮喘，且基于动物模型的研究也证实RSV毛细支气管炎反复喘息可发展成支气管哮喘[4-5]，但RSV毛细支气管炎与哮喘之间的关系及其发生机制目前尚不完全清楚。本研究通过检测RSV毛细支气管炎及相关哮喘患儿的中性粒细胞及其分泌因子MMP-9的表达水平来探讨二者是否参与气道炎症反应，继而为RSV毛细支气管炎是否发展成为支气管哮喘提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取黄石市中心医院儿科2015年1月至2017年12月门诊及住院确诊的支气管哮喘及毛细支气管炎患儿共88例作为观察组，其中，男孩56例，女孩32例，年龄3个月～8岁，平均年龄 (4.1±3.8)岁，将其分为3个组，即RSV毛细支气管炎组(A组)30例、来源RSV毛细支气管炎的哮喘组(B组)23例、非来源RSV毛细支气管炎的哮喘组(C组)35例；另选取某社区正常儿童30例作为对照组，即D组；其诊断标准均参照全国小儿肺炎防治方案中毛细支气管炎的诊断标准与支气管哮喘防治指南[5-6]。

1.2 外周血白细胞及中性粒细胞计数

采用吉姆萨染色及流式细胞术行细胞学鉴定，用流式细胞术对白细胞及中性粒细胞进行计数。

1.3 外周血中MMP-9表达水平检测

采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测外周血血浆中MMP-9的表达水平。分别收集离心所得血浆置于-70 ℃保存待测。试验步骤严格按照试剂盒(Sigma公司提供，批号：KA0179)说明书进行操作，采用全自动酶标仪进行检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 中性粒细胞形态学结构变化

外周血中性粒细胞经吉姆萨染色、流式细胞术鉴定，发现成熟中性粒细胞形态学结构为核呈深染的弯曲杆状(马蹄铁形)或分叶状，分叶核一般为2～5叶，正常人以2～3叶者居多，叶间有纤细的缩窄部相连；胞质内含有许多细小颗粒(MMP-9可能为其成分之一)。中性粒细胞形态学结构如图1所示。

(a) 400倍 (b) 100倍

2.2 4组患儿外周血白细胞及中性粒细胞计数比较

4组患儿外周血白细胞和中性粒细胞计数比较见表1。A组、B组及C组患儿外周血白细胞及中性粒细胞计数均明显高于D组(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；A组、B组患儿外周血白细胞及中性粒细胞计数高于C组(P<0.05，P<0.05)；A组与B组患儿外周血白细胞及中性粒细胞计数比较，无明显差异(P>0.05)。

表1 4组患儿外周血白细胞和中性粒细胞计数比较

注：△为D组与C组比较，P<0.05；△△为D组与A组、B组比较，P<0.01；■为C组与A组、B组比较，P<0.05。

2.3 4组患儿外周血中MMP-9表达水平比较

4组患儿外周血中MMP-9表达水平比较见表2。A组、B组、C组外周血中MMP-9含量均明显高于D组(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；A组、B组外周血中MMP-9含量高于C组(P<0.05，P<0.05)；A组与B组的外周血中MMP-9表达水平比较，无明显差异(P>0.05)。

表2 4组患儿外周血中MMP-9表达水平比较

注：△为D组与C组比较，P<0.05；△△为D组与A组、B组比较，P<0.01；■为C组与A组、B组比较，P<0.05。

2.4 不同组别中性粒细胞计数及MMP-9表达水平的相关性

A组、B组及C组患儿中性粒细胞计数与MMP-9表达水平呈正相关关系(r=0.675，0.824，0.442，P<0.05)。

3 讨论

RSV是目前2岁以下婴幼儿下呼吸道感染最重要的病源体之一。本研究结果显示，A组患儿外周血中性粒细胞明显高于D组；其结果与亢相逢等的研究结果一致[7-11]，说明中性粒细胞及其释放的炎性细胞因子介导的炎症反应在毛细支气管炎的发生发展过程中起着非常重要的作用。

既往研究证实，中性粒细胞与婴幼儿时期患RSV毛细支气管炎及儿童时期患支气管哮喘具有密切相关性[12-13]。本研究结果显示，A组、B组患儿外周血白细胞及中性粒细胞计数均高于C组，说明炎性细胞(中性粒细胞)在其疾病的发生发展中可能参与炎症反应。对结果作进一步分析发现，A组与B组白细胞及中性粒细胞计数比较无明显差异。结合上述结果及相关文献资料研究，推测中性粒细胞在RSV毛细支气管炎及相关哮喘疾病炎症反应中可能起到重要作用。

中性粒细胞属于炎性细胞，在疾病的发生发展过程中参与炎症反应，其分泌的炎性因子MMP-9也参与炎症反应。本研究结果显示，A组、B组及C组患儿外周血MMP-9表达水平均明显高于D组；其与李伟等的研究结果一致[14-15]，说明MMP-9参与了气道炎症反应。同时对A组与B组进行比较发现，其外周血中MMP-9表达水平无明显差异，但均高于C组，因此认为MMP-9参与了RSV毛细支气管炎及其相关支气管哮喘的炎症反应。

有研究表明，既往感染RSV患儿出现喘息症状较未曾受感染者次数增加[16]，并且证实MMP-9参与气道的炎症反应与重塑过程，王忠敏等研究发现小鼠气道重塑可能与肺组织MMP-9过度表达有关[17-18]；结合本研究发现A组及B组患儿外周血MMP-9表达水平均明显高于D组、而且高于C组；对上述结果进行皮尔森相关性分析，显示A组、B组及C组患儿的中性粒细胞计数与MMP-9表达水平呈现正相关(r=0.675，0.824，0.442，P<0.05)；因此认为RSV感染引起的毛细支气管炎与支气管哮喘关系十分密切；其发生发展过程与MMP-9有密切关联。

综上所述，中性粒细胞和MMP-9在RSV毛细支气管炎与后续诱发喘息过程中起到非常重要的作用；并且与该病情的严重程度密切相关[19]。因此推测中性粒细胞及其分泌因子MMP-9通过参与气道炎症及重塑导致RSV毛细支气管炎发展成为支气管哮喘。其发生、发展的影响和机制仍需进一步的研究阐明。