安徽省非结核分枝杆菌临床分离率及人群分布和耐药性分析

包训迪 江跃 梁锁 程红燕 夏广秀 王超 叶倩 王舒 王庆

非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除了结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外的分枝杆菌，在自然界中广泛分布，已知的NTM数量可达190余种[1]。人和动物均可感染NTM，主要引起肺部和皮肤病变等，临床表现与肺结核相似，而且传统的痰涂片、痰培养均不能与结核分枝杆菌相鉴别，导致NTM感染常被误诊为结核病或耐药结核病，引起治疗不当，病情延误，严重影响患者的预后[2]。随着近年来NTM菌株分离率的增高，其危害性也越来越受到大家的重视[3]。笔者对安徽省2015—2016年度结核病耐药性基线调查收集的菌株进行分离鉴定，初步了解安徽省NTM临床分离株在不同人群中的分布特征及其耐药性，为我省NTM的防治提供有效参考。

材料和方法

1.研究材料：参照《WHO耐药监测指南(第4版)》[4]按照分层整群抽样的方法，在全省86个结核病门诊抽取42个调查点，连续纳入2015年9月15日至2016年8月31日的涂阳疑似肺结核患者3047例，按照文献[5]进行痰标本酸性罗氏培养，对获得的2652株培养阳性菌株行菌种鉴定[对硝基苯甲酸(PNB)培养和早期分泌蛋白(MPB64)胶体金法]和基因测序(16S rRNA和hsp65 DNA测序)，再对其中的NTM临床分离株在不同人群中的分布特征和耐药性检测(微孔板法)进行研究和分析。

2.试剂和仪器：(1)罗氏培养基(L-J)、PNB (500 mg/L)培养基均购自珠海贝索生物技术有限公司；结核分枝杆菌复合群特异性早期分泌蛋白(MPB64)检测试剂盒(胶体金法)购自杭州创新生物检控技术有限公司；分枝杆菌菌种鉴定采用16S rRNA 和hsp65两个同源序列分析同源DNA序列组成差异鉴定细菌至种水平，引物合成及测序测定由上海生工生物工程有限公司完成；NTM药物敏感性试验(简称“药敏试验”)检测试剂盒(微孔板法)由珠海银科医学工程股份有限公司提供(含15种药品)。(2)BACspreaderTM1100c细菌超声分散计数仪由广东体必康生物科技有限公司提供；YK-909分枝杆菌微孔板药敏读仪、YK-96小型全自动移液平台均由珠海银科医学工程股份有限公司提供。

3.菌种鉴定方法：(1)按照试剂盒说明书和结核病实验室检验规程进行操作，应用MPB64抗原和PNB鉴别培养基对培养阳性菌株进行初步鉴定。当PNB培养基有细菌生长或MPB64抗原检测呈阴性则初步鉴定为NTM。(2)挑取初步鉴定为NTM的菌株接种环一环，加入100 μl纯水，涡旋振荡重悬。95 ℃金属浴孵育30 min，37 kHz 80 W超声裂解15 min；离心半径8.2 cm，12 000 r/min 离心5 min，上清液即为DNA。(3)NTM菌种鉴定的DNA引物采用16S rRNA和hsp65两个同源序列，分析鉴定细菌至种水平。将16S rRNA和hsp65测序序列提交NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性比较。依据鉴定菌种的DNA序列与参照菌种的同源性≥97%[6]来确定菌种。

4. NTM的药敏试验：采用液基微孔板法[7]对选取的对数生长期培养阳性的菌株进行15种药品的NTM药敏试验，应用细菌超声分散计数仪进行细菌的超声比浊定量，按照NTM药敏检测试剂盒(微孔板法)说明书进行操作判读。不同药品的最低抑菌浓度(MIC)判读耐药的标准为：利福平：≥6 μg/ml；克拉霉素：≥16 μg/ml；亚胺培南-西司他丁：≥16 μg/ml；阿奇霉素：≥16 μg/ml；利奈唑胺：≥32 μg/ml；阿米卡星：≥64 μg/ml；乙胺丁醇：≥2.5 μg/ml；利福布汀：≥2 μg/ml；头孢西丁：≥80 μg/ml；妥布霉素：≥16 μg/ml；莫西沙星：≥8 μg/ml；加替沙星：≥1 μg/ml；多西环素：≥8 μg/ml；米诺环素：≥8 μg/ml；磺胺甲唑：≥80 μg/ml。

5.统计学处理：采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析。计数资料的比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. 菌种鉴定及流行病学分布特征：对2652株培养阳性菌株采用PNB培养和MPB64胶体金法行初步菌种鉴定，结果显示：2530株为结核分枝杆菌复合群，122株为NTM，其中115株菌株在PNB培养基上生长，116株菌株MPB64抗原检测呈阴性(表1)；进一步对122株NTM菌株进行基因测序(16S rRNA和hsp65 DNA测序)，最终鉴定为NTM分离株107株[符合率为87.70%(107/122)]、结核分枝杆菌12株、诺卡菌1株、污染菌2株，NTM分离率为4.03%。不同临床特征人群结核分枝杆菌和NTM菌株的分布情况见表2。

表1 MPB64抗原和PNB培养对NTM的检测结果(株)

表2 不同临床特征研究对象的结核分枝杆菌和NTM菌株分离情况

续表2

注分离率=NTM菌株数/培阳菌株数×100%；统计学检验为NTM分离率在不同特征研究对象中的差异。a:指除农民、工人、退休、待岗以外的人员，如事业单位员工、商业人员等；b：安徽省地区行政区域分布以长江和淮河为界，划分为皖北、皖中和皖南三个地区

2.NTM菌种特征序列比对结果：107株NTM经菌种鉴定共计分离出6种优势流行菌种(表3)。

表3 基因测序鉴定的NTM菌种结果

3. NTM药敏试验检测：对107株NTM菌株进行药敏试验，106株获得药敏试验结果，1例胞内分枝杆菌菌株复苏失败未获得菌株。除外草分枝杆菌和马赛分枝杆菌各1株，仅统计其他4种104株NTM的药敏试验结果。结果显示不同NTM对阿米卡星、利福布汀、克拉霉素和利福平的敏感度较高[分别为87.50%(91/104)、86.54%(90/104)、83.65%(87/104)、75.00%(78/104)]，对亚胺培南/西司他丁、头孢西丁、米诺环素、多西环素等的耐药率较高[分别为100.00%(104/104)、95.19%(99/104)、94.23%(98/104)、93.27%(97/104)](表4)。

讨 论

近些年，随着各种新诊断技术在结核病检测中的推广和应用，NTM的分离率呈现逐年增高的趋势，国内外关于NTM及NTM肺病报道和研究也越来越多。NTM肺病的临床症状与肺结核非常相似，极易发生误诊；又因其对传统的抗结核药品耐药率较高，如错误使用抗结核药品治疗，则效果多不理想[8-9]，易被误诊为耐药结核分枝杆菌感染，给临床诊治带来很大困惑。因此，NTM的鉴定和耐药性检测将会为区分结核分枝杆菌和NTM的鉴别诊断和治疗提供有力保证。

表4 不同药品在104株不同NTM中的耐药情况[株(耐药率，%)]

我国2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查[10]结果显示，NTM的分离率从1990年的4.9%升高至2000年的11.1%，继而升高至2010年的22.9%，说明我国的NTM病疫情呈明显上升态势。本研究对2652株分枝杆菌菌株，经PNB和MPB64抗原初步鉴定分离出NTM菌株122株，经基因测序方法最终确认107株为NTM，检出率为4.03%，远低于22.9%的全国平均水平，可能是本次纳入的患者仅为涂阳患者，而未纳入症状较轻或涂阴疑似患者，从而导致NTM的检出率低于实际发病率。另外，我省NTM的检出率也低于多数沿海省份的分离率(10.20%～15.13%)[11-13]，但与周边河南(2.9%，5/171)[14]、江苏地区(3.37%)[15]的NTM分离率基本接近，可能与NTM的地域和地形分布有关。近年来的一些文献报道认为，NTM分离率呈现沿海高于内地、南方高于北方的地区流行特点[16]，提示NTM分布受地区影响；安徽省地处江淮平原，长江以北多为平原地区，长江以南为丘陵地区，平原地区人口众多，结核病患者数量也较多[17]，本研究皖北皖中地区的NTM检出率高于皖南地区，与本地区结核病的发病情况基本一致。

在不同特征人群中，NTM的检出率也有差异。有研究指出，在60岁以上人群中分离出NTM较多，可能与该人群免疫力降低有关，也可能与疾病的相关性下降(即感染NTM并不一定发生NTM病)考虑呼吸道NTM定植有关[18]。本次调查发现，NTM的分离率在60岁及以上、农民、低收入、低文化程度人群中的检出率较高，这与本地区结核病患者的发病人群比例[10]也基本一致，提示在上述分类人群中，结核病和NTM病的患病率均较高，在诊治过程中应重视两病的鉴别。本研究还发现，复治患者的NTM分离率明显高于初治患者，但目前尚未发现其他相关研究，可能与复治结核病患者更关注呼吸系统疾病，就医意愿及频率更高有关；女性NTM病患者的检出率明显高于男性，与Cassidy等[19]的研究结果基本一致，可能与女性寿命更长、身体免疫力较弱、就医意愿更强等有关，提示应重视我省复治、女性结核病患者NTM的鉴定，以避免误诊。

不同地区的NTM感染种群类型存在地区差异。有研究显示，广东地区的NTM优势菌为龟脓肿分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌复合群[20]，而上海地区优势流行菌种为龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌[21]。本研究107株NTM分离株中，胞内分枝杆菌占比最高，与Pang等[22]多中心研究基本一致，说明胞内分枝杆菌在我国可能是优势NTM菌株[23-26]；其次为脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌，草分枝杆菌和马赛分枝杆菌各分离出1株，与上述研究的NTM分布有较大差距，说明不同的NTM在不同的生长环境下有其不同的生长特性，本研究NTM分布及耐药性结果可为本省NTM的流行趋势提供参考。

既往研究证明，NTM对大多数的抗生素基本耐药[27]，耐药率较高。本研究根据CLSI M24-A第三版标准[28]，对获得的107株NTM分离株采用液基微孔板法检测了不同NTM对15种抗生素的耐药性。结果显示，胞内和鸟分枝杆菌对于抗生素的耐药率要高于脓肿分枝杆菌，其中胞内分枝杆菌对米诺环素、磺胺甲唑、多西环素、头孢西丁、阿奇霉素等抗生素的耐药率均达到90%以上；脓肿分枝杆菌对乙胺丁醇、加替沙星、多西环素、米诺环素、磺胺甲唑等抗生素的耐药率也达到了80%以上；而不同分枝杆菌对亚胺培南/西司他丁的耐药率均高达100.00%。另外，胞内和鸟分枝杆菌对阿米卡星和克拉霉素的敏感性均较高，与曹杨荣[29]的研究认为阿米卡星和克拉霉素的联合应用对NTM的治疗效果较好的结论基本一致；提示对我省NTM感染患者在没有药敏试验结果而需要进行临床治疗时，可优先使用这些抗生素进行治疗。目前，关于NTM的药敏试验研究主要集中于对抗结核药品的耐药性分析，而NTM对于抗结核药品的耐药率普遍较高[27,30]，研究意义不大。也说明对NTM应选择合适的治疗药品进行药敏试验，对抗结核药品的药敏试验并不适用于NTM。

目前，基层实验室的NTM鉴定主要依靠传统分离培养和菌种鉴定技术，耗时较长，且方法较为繁琐，现有的一些分子生物学方法可以快速鉴别，但设备昂贵，对实验室及检验人员要求较高，在基层开展较为困难。本研究结合传统的病原学和免疫学方法(PNB和MPB64抗原联合检测)，从2652株培养阳性分枝杆菌菌株中初步筛选出122株NTM菌株，再经16S rRNA和hsp65两个引物进行扩增测序，最终获得107株NTM菌株，符合率为87.70%，与其他研究基本一致[31-32]。说明在基层实验室，如果受条件限制，不能开展分子生物学检测，可以先开展较为简便且易操作的病原学和免疫学方法检测，如果初筛检测出NTM感染，可以先考虑按照NTM标准诊疗方案进行治疗，再将标本送至有检测能力的实验室，根据分子生物学方法鉴定和药敏试验结果调整治疗方案，这样可大大优化诊治流程，缩短诊疗时间，为患者的诊断和治疗提供方便。此外，微孔板法药敏试验是近年发展出来的检测技术，需要加强质量控制工作。本研究的药敏试验检测过程中，参加了中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室的药敏室间质量控制项目，取得了优秀成绩；但此次质量控制覆盖的药品种类较少，主要是常见的抗结核药品，对于NTM药敏试验检测的质量控制较少，期望未来将NTM药敏试验检测室间质量控制作为重点发展方向。

本研究是安徽省第一次进行系统性的NTM监测分析，由于条件限制，在患者纳入、菌种鉴定方法的选择上存在一定的局限，可能会导致NTM分离率存在一定的误差。但笔者认为研究结果仍可为安徽省NTM的病原谱和耐药性提供初步的基线数据，为以后的持续性监测提供参考。随着各种检测技术的不断更新发展，鉴定出的NTM菌种也会不断增多，可能会对NTM病的临床诊断造成一定干扰。因此，提升实验室的鉴别诊断水平，监测分析NTM的流行病学特征、菌种特性和耐药性，以便为NTM病的早期诊断和治疗提供依据。