西方饮食联合小剂量四氯化碳构建非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型研究

康建华，李明杰，栾培培，陈源文，彭文辉，简蔚霞

1. 上海交通大学医学院附属新华医院内分泌科，上海 200092；2.同济大学附属第十人民医院心血管内科，上海200072；3.上海交通大学医学院 附属新华医院消化内科，上海200092

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的严重病理类型。目前，NAFLD 在全球及亚洲人群患病率均约为25%[1-2]，随着肥胖及糖尿病患者的不断增加，NAFLD 患病率将会继续升高。虽然大部分NAFLD 患者疾病状态只停留在非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）阶段，但是仍有部分患者可向NASH 及肝纤维化进展，最终发展为肝硬化、肝癌。在美国，NASH 导致的终末期肝病是肝移植的第三大病因[3]。尽管NASH 是我国目前常见的慢性肝病之一，但迄今为止其发病机制尚不完全清楚，也无特异性治疗方法及特效药物。对于NASH 的机制研究和药物开发来说，目前最大的障碍是缺乏标准的动物模型。现有的研究中，使用较多的NASH 动物模型是通过高糖高脂饮食或甲硫氨酸胆碱缺乏饮食来构建，然而这些模型都不能体现出NASH 向肝纤维化、肝癌的演变过程[4]。本研究采用西方饮食（Western diet，WD）联合腹腔注射小剂量四氯化碳（CCl4）的方法来构建小鼠NASH 相关肝纤维化模型，同时对模型进行动态病理学观察，在CCl4注射的不同时间点对代谢指标及肝功能等指标进行连续动态检测，明确各种病理改变发生的具体时间节点，以期为NASH 的病程进展、病理机制研究和干预治疗提供可靠的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级C57BL/6 雄性小鼠52 只，8 周龄，体质量为（22.37±1.21）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司[实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2017-0011]。小鼠饲养于上海同济生物医药技术有限公司动物房[实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2018-0034]，温度约24 ℃，湿度约60%，小鼠自由摄食和饮水，12 h 昼夜交替光照。

1.1.2 主要试剂及仪器 WD 小鼠饲料（脂肪含量21.1%、蔗糖含量41.0%、胆固醇含量1.3%）购自北京博泰宏达生物技术有限公司，普通小鼠饲料购自江苏协同医药生物工程有限责任公司，CCl4（批号为180720）购自上海试一化学试剂有限公司，葡萄糖（货号为G8270）、果糖（货号为F0127）、油红O 染液（货号为O1391）购自Sigma（美国），柠檬酸钠修复液（货号为G1202）、苏木精染液（货号为G1004）购自武汉赛维尔生物科技有限公司，即用型正常山羊血清（货号为AR0009）、内源性过氧化物酶阻断液（货号为AR1108）购自武汉博士德生物工程有限公司，DAB 显色试剂盒（货号为SK-4100）购自Vector Laboratories（美国），增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体（货号为2586）购自Cell Signaling Technology（美国），TdT 介导的脱氧核苷酸切口末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）试剂盒（货号为11684817910）购自Roche（瑞士），EdU 细胞增殖检测试剂盒（货号为C10337）、TRIzol 试剂（货号为15596026）购自Invitrogen（美国），SYBR 快速定量PCR 试剂盒（货号为KM4101）购自KAPA（美国），反转录试剂盒购自TaKaRa（日本），Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ）扩增引物（上、下游序列分别为5'-CCAAGAAGACATCCCTGGGAAA-3' 和5'-TGCACGT- CATCGCACACA-3'）由上海生工生物工程股份有限公司合成。市售玉米油购自本地超市，均为同一品牌同一批次 产品。

全自动生化分析仪（Au640，日本Olympus）、实时荧光定量PCR 仪（LightCycler96，瑞士Roche）、血糖仪及试纸（YZB/USA 5059-2012，德国Bayer）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备方法 将52 只小鼠随机分为对照组（control group）和模型组（model group），对照组16 只，模型组36 只；适应性喂养1 周后，开始造模。对照组小鼠食用普通饲料和纯净水；模型组食用WD 饲料，饮用水含有23.1 g/L 果糖和18.9 g/L 葡萄糖。另外，模型组小鼠每周（饮食造模开始时即进行首次注射）按每克体质量0.2 μL 的剂量腹腔注射CCl4（按体积1:9 溶于玉米油中），对照组小鼠同时腹腔注射等体积的玉米油。

1.2.2 代谢及肝指数检测 造模期间每周称量小鼠体质量，并记录。分别于第4、8、12、16、20 周（本文中第n周均指第n 周末，即造模开始后n 周）处死6 只模型组小鼠和2 只对照组小鼠，于第24 周处死2 组余下的小鼠。小鼠处死前12 h 禁食，临处死前称量体质量；用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物后，心脏取血；然后迅速取出肝脏，称取肝脏质量，计算肝指数（肝指数=肝脏质量/体质量）。

1.2.3 血糖及糖耐量检测 空腹血糖检测：造模前（第0周）以及造模后不同时间点（第8、16、24 周）检测小鼠空腹血糖。检测前1 日20 时开始禁食，禁食12 h 后，尾静脉采血，用血糖仪检测空腹血糖。葡萄糖耐量测定：造模后第24 周时进行小鼠糖耐量检测。小鼠禁食12 h，称重记录后测量空腹血糖值，然后以2 mg/g 的剂量腹腔内注射葡萄糖溶液，用血糖仪测定注射后15、30、60、120 min 小鼠尾静脉血的血糖水平。

1.2.4 血清生化检测 小鼠心脏取血后，血液放置2 h，然后于4 ℃13 523×g 离心10 min，收集血清，用全自动生化分析仪测定第8、16、24 周小鼠血清中三酰甘油（TAG）、谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT） 水平。

1.2.5 肝脏组织病理学检测 分离肝脏后留取相同部位的部分肝组织，分别制作冰冻切片和石蜡切片；冰冻切片用于油红O 染色，石蜡切片用于天狼猩红染色和苏木精-伊红（H-E）染色；然后在普通光学显微镜下观察肝脏脂肪堆积、胶原沉积和形态学变化的情况，并进行肝组织病理学的等级评分。

每只小鼠选取3 张切片，200 倍镜下，随机观察20 个视野，采用2005 年美国NASH 临床研究工作组（Clinical Research Network，CRN）提出的标准[5]进行NAFLD 活动度积分（NAFLD activity score，NAS）评定和肝纤维化评分，用于NASH 严重程度分级。

NAS 评定从3 个方面分别评分。①肝脂肪变性。显微镜下估计肝脂肪变性的面积：＜5%，0 分；≥ 5%且＜33%，1 分；≥ 33%且＜66%，2 分；≥ 66%，3 分。② 肝小叶炎症。显微镜下计数有炎症反应的视野数：0 个，0 分；＜2 个， 1 分；≥ 2 个且＜4 个，2 分；≥ 4 个，3 分。③肝细胞气球样变性。无，0 分；少见，1 分；多见，2 分。3 项得分相加，总和1 ～2 分排除NASH，3 ～4 分为NASH 可能，5 ～8 分确诊NASH。

CRN 系统对NASH 纤维化评分根据逐渐发展的纤维化进程分为5 级，对应评分0 ～4 期。①0 期：无纤维化。②1 期：窦周纤维化或门脉周围纤维化。1 期又被细分为轻度3 区（中央静脉周围）窦周纤维化（1A 期）和重度3 区窦周纤维化（1B 期），以及仅有汇管区纤维化（1C 期）。③2 期：窦周纤维化合并汇管区周围纤维化。④3 期：纤维桥形成。⑤4 期：肝硬化。

1.2.6 免疫组织化学染色 制作石蜡切片后依次进行烤片、脱蜡、水化、抗原修复（柠檬酸钠pH 6.0，微波加热）、灭活内源性过氧化氢酶，经山羊血清封闭后，4 ℃一抗孵育过夜，室温孵育二抗，应用生物素亲和素放大信号后采用DAB 显色法检测肝组织中PCNA 的表达情况。每只小鼠选取3 张切片，400 倍镜下选取5 个以上典型视野，计算平均阳性细胞数。

1.2.7 肝组织细胞凋亡的检测 TUNEL 法原位检测肝组织切片细胞凋亡的情况。石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，用15 μg/mL 蛋白酶K 工作液于37 ℃孵育组织切片20 min，滴加TUNEL 反应液进行标记反应（37 ℃，60 min）后用POD 转换液37 ℃孵育30 min，最后采用DAB 显色法检测。每只小鼠选取3 张切片，400 倍镜下选取5 个以上典型视野，计算平均凋亡细胞数。

1.2.8 实时荧光定量PCR 取部分肝组织，用TRIzol提取RNA 后，用反转录试剂盒生成cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR（qPCR）检测肝组织中纤维化相关基因collagen Ⅰ的表达情况。PCR 反应体系：2×FASTStart 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 5 s，共35 个循环；72 ℃ 5 min。利用2-ΔΔCT法进行数据分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0 和GraphPad Prism 6 软件进行数据分析。定量资料用±s 表示，组间比较行独立样本t 检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况

在造模过程中，对照组小鼠生长及生活习性正常，毛色光泽；而模型组小鼠随着造模时间的延长，皮毛日渐疏松且油腻，精神萎靡。对照组和模型组小鼠体质量均逐渐增加，模型组小鼠体质量稍高于对照组小鼠，但曲线下面积组间差异无统计学意义（P=0.507，图1A）。模型组小鼠的空腹血糖曲线下面积与对照组之间的差异无统计学意义（P=0.592，图1B）。第24 周时进行小鼠葡萄糖耐量的测定，并计算曲线下面积来评价葡萄糖耐量的改变，结果显示模型组较对照组葡萄糖耐量的差异无统计学意义（P=0.261，图1C、D）。

图1 造模过程中小鼠的代谢情况Fig 1 Metabolism of mice during modeling

2.2 肝脏变化及肝指数情况

采血后迅速分离肝脏，观察可见对照组小鼠肝脏表面光滑，色泽鲜红，质韧，边缘锐利；而模型组小鼠第8 周开始肝脏表面光泽变差，颜色偏黄白，有油腻感，边缘变钝（图2）。称量肝脏质量后计算肝指数，结果显示造模 8 周后肝指数即明显增加，模型组第8、12、24 周肝指数与对照组相比，差异均有统计学意义（均P＜0.05，表1）。

图2 2 组小鼠肝脏照片Fig 2 Photos of mice livers in the two groups

表1 2 组小鼠肝指数比较Tab 1 Liver index comparison between the two groups

2.3 血清学指标变化

小鼠取血后分离血清，分别检测血清中GPT、GOT及TAG 的含量。结果显示，模型组与对照组相比，血清GPT 和GOT 的含量明显增高，第24 周时差异具有统计学意义（均P＜0.05，表2）。与对照组相比，造模第8 周血清中TAG 含量增加不明显，但造模第24 周时血清中TAG含量均明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 2 组小鼠血清生化指标的比较 Tab 2 Comparison of biochemical indexes between the two groups

2.4 肝组织H-E 染色与油红O 染色分析

显微镜下可观察到对照组小鼠肝细胞呈多边形，细胞质丰富，细胞核位于细胞中央，小叶结构清晰，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，除有少量细胞出现小泡性脂肪变性外，无气球样变性及炎症细胞浸润。模型组第8 周时肝脏可见肝小叶结构稍有紊乱，肝细胞脂肪变性明显较对照组增多，以小泡性脂肪变性为主；第16 周时肝细胞脂肪变性更加严重，为大、小泡混合型脂肪变性，夹杂部分气球样变肝细胞，且可见不同数量的炎症细胞浸润及点状坏死灶；第24 周时肝细胞脂肪变性减轻，可见大量炎症细胞浸润，小叶内点灶性坏死等病变明显加重（图3A）。NAS 评定结果显示，模型组第16 周和第24 周时平均NAS 均显著高于对照组（均P=0.000），且平均评分均＞4 分（图3B）。油红O 染色结果显示，模型组第8 周时可见肝细胞胞质内含有大量红色脂滴，第16 周时肝细胞胞质内所含脂滴量达到高峰，到第24 周时脂滴有所减少（图3A）。分析油红O 染色面积，结果显示模型组小鼠肝细胞中油红O 染色面积均大于对照组，差异具有统计学意义（均P=0.000，图3C）。

图3 2 组小鼠肝脏H-E 染色和油红O 染色分析Fig 3 Analysis of H-E staining and oil red O staining of mice liver in the two groups

2.5 肝组织纤维化检测结果

石蜡切片经天狼猩红染色后，镜下观察胶原的沉积情况。结果显示，对照组小鼠肝组织中未见肝纤维化；而模型组小鼠随着造模时间的延长，肝组织的纤维化程度逐渐加重，造模第8 周时仅有窦周纤维化或汇管区周围纤维化（1 期），造模第16 周时出现窦周纤维化合并汇管区/汇管区周围纤维化（2 期），造模第24 周时有纤维桥形成（3期）（图4A）。分析胶原面积，模型组第16 周和第24 周肝组织的胶原面积显著大于对照组，差异均具有统计学意义（均P＜0.05，图4B）。qPCR 结果显示，随着模型病程的进展，纤维化相关基因collagen Ⅰ的表达逐渐增多，差异具有统计学意义（均P＜0.05，图4C）。这些结果表明随着造模时间的延长，模型小鼠肝脏向着纤维化方向不断 进展。

图4 2 组小鼠肝脏纤维化检测结果Fig 4 Detection results of liver fibrosis in the two groups

2.6 肝组织细胞凋亡和增殖检测结果

应用TUNEL 法检测造模过程中肝组织细胞的凋亡情况，阳性表达主要见于细胞核，为棕黄色。对照组小鼠肝组织内只有极个别TUNEL 阳性细胞。模型组第8 周时肝组织内TUNEL 阳性细胞数达到高峰，阳性细胞以肝细胞为主，一些血窦细胞和内皮细胞也呈阳性；第16 周时，凋亡细胞数量仍较多，散在分布于肝腺泡中，以脂肪变性严重及点状坏死区域较多见，少数凋亡细胞内可见残留细胞空泡；第24 周时TUNEL 阳性细胞数有所下降（图5A）。统计TUNEL 阳性肝细胞数，可见随着造模时间延长，凋亡的肝细胞在逐渐减少，且各个时间点间差异具有统计学意义（均P＜0.05，图5B）。应用免疫组织化学法检测PCNA 表达情况，从而判断肝细胞的增殖情况。PCNA 在细胞核表达，对照组小鼠肝组织有少量PCNA 表达阳性肝细胞；模型组第8 周时PCNA 阳性表达的细胞较对照组明显增多，且随着造模时间延长，PCNA 表达阳性的肝细胞呈渐增的趋势，以中央静脉周围及点灶坏死区内多见，同时PCNA 也表达于肝血窦内皮细胞、肝星状细胞等间质细胞的细胞核中（图5A）。统计PCNA 阳性肝细胞数，可见随着造模时间延长，增殖的肝细胞在逐渐增多，各个时间点间差异具有统计学意义（均P=0.000，图5C）。

图5 TUNEL 法细胞凋亡检测结果和PCNA 表达免疫组织化学结果Fig 5 Results of the level of apoptosis by TUNEL and the level of PCNA by immunochemistry

3 讨论

近年来，随着饮食结构和生活方式的改变，NAFLD的发病率不断攀升。中国成人NAFLD 患病率为6%～ 27%（检测方式有所不同），NAFLD 年发病率为3.4%～ 9.1%[6-8]。根据肝组织脂肪变性是否伴有炎症反应和纤维化，NAFLD 可分为NAFL、NASH 和NASH 相关肝硬化3 个阶段[9]。既往研究[10]表明，在病程的NAFL 阶段，只要积极给予干预，NAFLD 可以被逆转；而NASH 是单纯性脂肪肝向肝纤维化和肝硬化过渡的关键环节，一旦进展到NASH 阶段，无论是否经过肝硬化均可发展为肝癌[11]。构建一个具备NASH 组织学特征且能同时反映NASH 向肝纤维化、肝癌进展的模型对NASH 的分子机制研究和药物开发显得十分重要。

目前，国内外用于科学研究的NAFLD 动物模型主要包括基因敲除或基因突变模型、营养或药物诱发的模型及联合应用基因模型和营养模型的复合模型3 种[12]，其中以高糖高脂饮食诱导最为常见[13-14]。但是这些模型大多只能反映NAFLD 病程的某个单一阶段，能够概括NAFLD 全病程的动物模型并不多见。在既往研究[15]中，研究人员通过改进胆碱缺乏饮食的方法建立了一种小鼠NASH 肝纤维化模型，但这种模型是由于胆碱缺乏导致脂质代谢功能受损而引起NASH，与临床发病机制不尽相同。本研究原本计划参照既往报道的WD 联合CCl4的方法[16]制造小鼠肝癌模型，但是结果发现，该方法无法制造肝癌模型，却意外成功制造了小鼠NASH 模型。该造模方法中的饮食模式更符合人类的饮食习惯，该模型更接近临床代谢性NASH 的疾病进程。

含有高脂肪、高果糖（或蔗糖）和高胆固醇的WD 已被广泛用于建立小鼠NASH 模型，这种饮食模式模拟了人们的快餐饮食习惯，与人类NASH 的发生有关；WD 不仅可以诱导小鼠肝脏脂肪变性，还可以诱导小鼠肥胖和胰岛素抵抗[17-18]。然而，单用WD 诱导的NASH 模型即使经过长时间（25 ～52 周）的喂养仍不能使病程进展到严重脂肪性肝炎和纤维化的阶段[18-19]。因其耗时较长，花费较高，对于实验研究来说并不是一个理想的动物模型。长久以来，CCl4都被用来诱导小鼠肝损伤和肝纤维化[20]，因其造模方便、时间短、成模率高的特点被广泛应用，但也因其死亡率高受到限制。然而研究表明，长期慢性应用CCl4诱导的模型首先出现3 区纤维化，而成人NASH 的纤维化也始于肝腺泡3 区，由胶原纤维和其他细胞外间质纤维沿3 区的窦周和肝细胞分布[21]，因此CCl4可以很好地模拟人肝脏纤维化病理变化过程；另外，CCl4的应用可以导致小鼠肝细胞发生气球样变性[22]，这是NASH 的典型病理变化之一。因此，我们联合WD 和小剂量CCl4来构建NASH模型，不仅极大缩短了单纯WD 喂养的造模时间，而且很好地模拟了NASH 病理进程，同时降低了大剂量CCl4造成的高死亡率。

在本研究中，我们还连续检测了造模过程中肝脏组织的病理生理动态变化，证实NAFLD 前期主要表现为肝细胞脂肪变性，随着炎症和肝细胞损伤的出现，脂肪含量下降，晚期出现肝纤维化。之前也有研究[23]表明，随着病程的延长，肝脏脂肪含量的下降与NAFLD 向进展性纤维化发展相关，至肝硬化阶段肝脂肪变性可完全消退。同时，通过TUNEL 法我们检测了NASH 病变过程中的细胞凋亡情况，证实细胞凋亡持续存在于NASH 的病变过程中，显示细胞凋亡是NASH 进展过程中重要的细胞损伤形式之一。从TUNEL 检测结果看，凋亡肝细胞主要分布于脂肪变性严重的区域，个别阳性肝细胞胞质中残留脂肪空泡，这些结果都提示脂肪变性或许与凋亡具有相关性，可能因为脂质的积累对细胞具有毒性作用，从而诱导细胞凋亡。通过PCNA 免疫组织化学实验，我们发现在造模早期，肝细胞增殖并不明显，随着造模的推进，肝细胞的增殖逐渐增多。综合这些结果表明，在NASH 早期阶段，肝细胞以凋亡为主，随着NASH 病程的进展，肝组织针对组织损伤的自我修复功能加强，表现为凋亡与增殖共同存在。另外，在一些点状坏死灶区域、窦周浸润的炎症细胞以及肝血窦内皮细胞、肝星状细胞等间质细胞细胞核中也可见PCNA 阳性表达，持续于整个病程，表现出NASH炎症及纤维化的进展状态。肝细胞增殖水平上升意味着细胞可能发生了异常增生，向肝癌进展的可能性增加。但本研究中小鼠模型第24 周时没有发现肝癌结节和恶性增殖的肝细胞，而既往研究显示利用同样的方法构建小鼠模型，造模第24 周时在部分小鼠中出现了肝细胞肝癌[16]，这种差别可能与采用不同厂家生产的饲料以及小鼠的个体差异有关。今后，可扩大样本、延长饲养周期进一步探讨制造NASH 相关肝癌模型的可能性。

综上所述，本研究采用WD 联合小剂量CCl4的方法构建了一种NASH 模型，该模型复制了NASH 的病理学特征（肝细胞脂肪变性、肝小叶炎症、气球样变性）及NASH 发生过程中血清中转氨酶的变化情况，并且基本体现了NAFLD 的自然进程，从第8 周时的NAFL 进展到第16 周时的NASH，再到第24 周时3 期纤维化的发生。该模型的成功构建为研究NASH 和NASH 相关肝纤维化提供了可靠的模型工具小鼠，为今后研究NASH 的病理生理机制奠定了较好的研究基础。

参·考·文·献

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