CALUX生物检测法测定垃圾焚烧厂周边农田土壤中的二噁英类

张会强,白 昭,王 斐,张秦铭,马文鹏,王雨薇

(1.陕西省环境监测中心站，陕西 西安 710054；2.国家环境二噁英监测西北分中心，陕西 西安 710054)

1 引言

二噁英类物质包括多氯二苯并二噁英(PCDDs)和多氯二苯并呋喃(PCDFs)，共计210种化合物。这类化合物通过进入动物细胞内与芳香烃受体(AhR)结合，调控下游基因转录，引发各种的毒性效应[1,2]，包括致癌、致畸、致突变和生殖毒性效应[3～6]。随着工业社会的发展，钢铁冶炼、垃圾焚烧、水泥生产、制浆造纸等行业排放产生的二噁英[7]，蓄积在土壤、底泥等环境介质当中，因其极难降解，随食物链放大并富集在动物和人体当中，影响食品安全和人体健康[8～10]。

2016年5月28日国务院印发了《土壤污染防治行动计划》，简称“土十条”，旨在加强土壤污染防治，保证土壤环境质量，保障农产品质量安全。土壤中的二噁英类的定量检测主要依据HJ 77.4-2008《土壤和沉积物二噁英的测定同位素稀释高分辨气相色谱-高分辨质谱联用法》(high resolution gas-high resolution mass spectrometer ，简称 HRGC-HRMS法)。该方法检测过程繁琐，成本高，周期长，需有昂贵的高分辨质谱检测，不适用于环境样品的大量筛选。荧光素酶报告基因法(the chemical-activated luciferase expression,以下简称CALUX法)是将荧光素酶作为报告基因插入到控制转录的DRE基因下游，制备成报告基因质粒并转染大鼠肝癌细胞构建的稳定转染的细胞株。含二噁英类的样品与细胞株共同孵育时，就会激活AhR信号通路，进而激活含DRD(dioxin responsive domain, DRD)报告基因的启动子，诱导荧光素酶的表达，加入荧光素酶底物产生荧光，荧光值与二噁英含量成正比[11]。CALUX法已经成为行业内二噁英快速筛选的“热点”方法[12～14]。

对某生活垃圾焚烧发电厂周边农田土壤进行了布点采样(1#～9#样品，详见图1)，采用快速溶剂萃取(ASE)进行样品提取，硫酸酸洗和多层硅胶柱净化，溶剂转换为二甲基亚砜(DMSO)后，利用CALUX法测定了土壤样品中的二噁英类。

2 实验部分

2.1 主要仪器与试剂耗材

(1)主要仪器设备,如表1所示。

(2)试剂与耗材。正己烷、二氯甲烷，色谱纯，均为Fisher品牌；甲苯、浓硫酸、浓盐酸，色谱纯，均为德国merck品牌；无水硫酸钠、氯化钠、硅藻土、优级纯，均为德国merck品牌；酸性硅胶柱、碱性硅胶柱、活性炭柱均为FMS品牌；CALUX细胞株和CALUX-Aid软件由美国XDSI公司授权使用；胎牛血清(FBS)、细胞培养用抗生素(Pen Strep简称P/S)、胰蛋白酶(Trypsin)、培养基(RPMI-1640)均为Gibco品牌；二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma品牌；细胞裂解液、荧光素酶试剂盒均为Promega品牌；2,3,7,8-TCDD(50μg·mL-1，DMSO溶剂)为Wellington品牌；30～300 μL八通道移液器，1-100 mL大容量电动移液器购自德国Sartorius品牌；XB-K-25型细胞计数板，购自上海求精生化试剂仪器有限公司；Mr.Frosty梯度降温盒，Nunc 96孔底透微孔板，均购自美国ThermoFisher公司；2 mL冻存管，50 mL离心管，10 cm细胞培养皿均购自美国Corning公司；其它玻璃器皿为实验室常用规格。

图1 某垃圾焚烧发电厂周边农田土壤采样布点

表1 主要仪器设备相关信息

2.2 实验步骤

2.2.1 样品的预处理 称取5.000g土壤样品经酸泡，过滤后，进行快速溶剂萃取，仪器条件：加热温度120℃，加热时间6 min，静态时间7 min，循环3次，清洗体积70%，吹气时间200 s。提取液经3次酸洗后用饱和氯化钠溶液水洗，经无水硫酸钠干燥后，旋转蒸发浓缩至约5 mL。经多层硅胶柱(酸性硅胶柱+碱性硅胶柱+活性炭柱)净化后，用正己烷定容至10 mL，分取5 mL转移到K-D管浓缩到1.0 mL,氮吹吹干，用200 μLDMSO定容，室温避光保存。

2.2.2 细胞实验 按照91% (RPMI-1640)+8%FBS+1%P/S的比例配制培养基。从-80℃超低温冰箱取出含CALUX细胞株的冻存管， 37℃恒温水浴快速解冻，吹打散后快速转入10 cm细胞培养皿进行细胞复苏。37℃,5%CO2恒温培养至长满90%培养皿后再进行细胞传代。将重复传代的细胞溶液1 000 rpm离心3 min后，加入培养基重悬。细胞计数并调节细胞密度为7.5×105cells·mL-1，此溶液为细胞种板溶液。按照每孔200 μL的细胞混悬液的量接种96孔板，每个孔接种15万个细胞，接种方式按照图2进行。然后将接种好的底透板做好标记后进行培养。

将50μg·mL-12,3,7,8-TCDD用DMSO进行逐级稀释，配制成下表2浓度值。对培养了14～24 h的96孔板进行细胞给药，然后置于37℃,5%CO2恒温培养箱中培养20～24 h。取出底透板，进行细胞裂解，于化学发光读扳机上进行上机检测，读取荧光响应值(RLU)。

图2 细胞种板布板方式

(备注：PBS表示磷酸盐缓冲溶液；NC表示DMSO溶剂空白；STD1～STD9表示标准系列；QC表示质控样；1#～9#表示样品。)

表2 标准曲线浓度

2.3 结果与分析

2.3.1 标准曲线结果 将上机检测读取标准物质的RLU值代入CALUX-Aid软件，得出图3荧光值对2,3,7,8-TCDD标准溶液的响应曲线。

图3 标准物质的荧光响应曲线

2.3.2 实验结果 将上机检测读取样品的RLU值代入CALUX-Aid软件，得出1#～9#农田土壤样品中的二噁英毒性当量浓度分别为7.05 ngTEQ·kg-1、7.95 ngTEQ·kg-1、6.20 ngTEQ·kg-1、14.16 ngTEQ·kg-1、8.42 ngTEQ·kg-1、4.06 ngTEQ·kg-1、7.07 ngTEQ·kg-1、4.93 ngTEQ·kg-1、3.50 ngTEQ·kg-1。NC样品未检出，QC结果在合格范围内。

2.3.3 结果讨论 9个样品均为某生活垃圾焚烧发电厂周边农田土壤，二噁英毒性当量浓度范围为3.50～14.16 ngTEQ·kg-1。均值为7.04 ngTEQ·kg-1低于荷兰和瑞士的农田土壤标准(10ngTEQ·kg-1)[15]。由图4可见点位与排放口的距离越远，二噁英浓度越低。该厂所处地理位置常年主导方向为南风，其中4#、5#和7#均位于该厂北面，因此，浓度值略高，其中4#超出了10 ngTEQ·kg-1的农田土壤标准限值。

图4 二噁英毒性当量浓度与采样点位距烟囱直线距离的关系

3 结论

与HRGC-HRMS法相比，CALUX法检验结果仅能指示2,3,7,8-TCDD的毒性当量值，并不能给出样品中二噁英组分的单体指纹特征及丰度，只能作为二噁英类快速筛选的半定量方法。但是，CALUX法利用哺乳动物细胞对二噁英进行暴露试验，检验结果直接反映人体健康风险，同时可以实现对大量样品的高通量检验，因此，CALUX法在实际应用中具有独特的优势和意义。