聚合物点/金纳米簇比率荧光探针的合成及其对三聚氰胺检测的应用

刘梦旋，孟 磊

(1.吉林化工学院 材料科学与工程学院，吉林 吉林 132022;2.吉林化工学院 理学院，吉林 吉林 132022)

三聚氰胺(Melamine)，又名：密胺、氰脲三酰胺、三聚氰酰胺.化学名称为1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺.三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，与甲醛缩合聚合可制得三聚氰胺树脂，这种树脂被广泛运用于木材、塑料、造纸、纺织、皮革等行业；三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等[1-2].由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，而三聚氰胺又无味不易发现，所以常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标.蛋白质主要由氨基酸组成,含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的分子式含氮量为66%左右.通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，因此添加三聚氰胺会使食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试[3-4].而长期或反复大量摄入三聚氰胺可能造成生殖、泌尿系统损害，膀胱、肾部结石等，并可能进一步诱发膀胱癌[5-6].所以开发一种能够在食品中快速高效检测三聚氰胺的方法是十分必要的.

目前三聚氰胺痕量的检测方法主要有红外光谱法、高效液相色谱法、色谱-质谱联用法、电化学法、酶联免疫吸附法、比色法等[7-13].然而上述几种方法，操作复杂、流程较长、设备昂贵，因此我们需要一种能够快速有效的方法来检测三聚氰胺.近年来出现的纳米荧光检测技术具有选择性好、灵敏度高、操作简便、经济实用等优点，已经被广泛用于痕量检测、荧光标记等领域[14-16].但是由于纳米荧光探针检测只基于单一的荧光变化，因此会受到仪器以及外部环境的干扰.新型的比率型纳米荧光探针能够基于两种不同的发射波长的荧光来检测目标物质，利用比率荧光的自校准作用能够有效排除外界干扰因素，从而能更加准确的对痕量三聚氰胺进行检测.

合成了一种聚合物点/金纳米簇比率荧光探针，该荧光探针的比率荧光探针由两部分组成，分别为含有大量氨基功能团的聚乙烯亚胺聚合物点(PEI-PDs)和羧基保护的金纳米簇(AuNCs)，制备得到的荧光探针能够通过比率荧光方法应用于三聚氰胺的痕量检测，并且对该荧光探针对三聚氰胺检测的抗干扰性、灵敏性、选择性等进行了检测.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

聚乙烯亚胺(PEI，MW 10000)，谷胱甘肽(GSH)购买于上海阿拉丁试剂公司.抗坏血酸(AA)，20种天然氨基酸(Val，Met，Cys，Ile，Pro，Arg，Phe，Gly，Gln，Glu，Thr，Trp，Ser，Ala，Asp，Lys，Leu，Asn，Tyr，His)购买于南京奥多福尼生物科技有限公司，所有的化学药品均是分析纯，且没有再纯化.超纯水用于整个实验过程.

荧光光谱采用LS-55荧光分光光度计测定(英国PE).所有玻璃耗材用电热鼓风干燥箱烘干(上海一恒科学仪器有限公司).观察荧光效果用ZF-20D暗箱三用紫外分析仪，紫外波长：254、365、254+365 nm，仪器功率40 w(上海骥辉科学分析仪器有限公司).

1.2 实验过程

(1)金纳米簇的制备

向摩尔浓度为20 mM的氯金酸(HAuCl4·3H2O)溶液中，加入谷胱甘肽(GSH)与氯金酸(摩尔比为2︰1 )在室温下搅拌孵育15 min，然后60 ℃水浴加热条件下，继续搅24 h，得到金纳米簇，最后将所得溶液在4 ℃条件下冷藏保存.[17]

(2)PEI点的制备

向超纯水中加入PEI，搅拌分散40 min，后加入还原剂AA(PEI:AA=50︰1)继续搅拌5 min后，将体系温度升至200 ℃，继续搅拌3 h，期间每隔18 min加一次水防止溶液全部蒸发.最后得到明亮的PEI点[18].

(3)比率荧光体系的组装

将制备好的金纳米簇和PEI按照质量比1︰0.35的比例加入到缓冲溶液中，使得混合溶液中PEI-PDs质量浓度为15 μg/mL，AuNCs的质量浓度为42.5 μg/mL.最后将混合溶液在室温下孵育10～20 min,得到PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针.

(4)对三聚氰胺进行检测

向准备好的待测样品中加入PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针，孵育两分钟后，测试其荧光光谱，通过观察其荧光强度比值(I615/I440)的变化可以实现对三聚氰胺的比率荧光检测.

(5)实物检测样品的预处理

为了除去样品牛奶中的蛋白质及脂肪，对牛奶样品进行预处理.取1 mL牛奶用水稀释至10 mL，然后加入2 mL 5%的三氯乙酸溶液，用漩涡仪混匀1 min，再超声处理30 min.之后，将该混合物在10 000 rpm速度下离心10 min.取上清液，再用0.2 mm的超滤膜过滤，滤液在4 ℃下保存备用.

2 结果与讨论

2.1 PEI-PDs与AuNCs质量浓度比对PEI-PDs/AuNCs荧光强度的影响

本文合成的PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针，由PEI-PDs和AuNCs两种荧光探针组成，制备过程简单、易操作、条件温和、耗时短，该荧光探针的最强激发波长为310～320 nm，最强发射波长在440～445 nm左右以及610～615 nm左右，具有比率荧光特征.为了了解PEI-PDs与AuNCs质量浓度比对PEI-PDs/AuNCs荧光强度的影响，将不同物质量的PEI-PDs与HEPES 缓冲溶液(pH为7.4)混合，得到PEI-PDs溶液，分别加入AuNCs，使得PEI-PDs与AuNCs的质量比为(0.2︰1、0.25︰1、0.3︰1、0.35︰1、0.4︰1)，搅拌10 min，自组装得到PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针.图1为不同质量浓度下的PEI-PDs对比率荧光探针荧光强度的影响.从图中可以看出当PEI-PDs与AuNCs的质量比为0.35︰1时，两种荧光强度比值最佳.

Wavelength/nm图1 PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针荧光强度随PEI-PDs与AuNCs质量浓度比变化的荧光光谱

2.2 PEI-PDs/AuNCs对三聚氰胺的响应时间

用本文合成的荧光探针对三聚氰胺进行检测，在PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针的HEPES缓冲溶液(pH为7.4)中加入20 μM三聚氰胺，如图2所示，随着时间的增加，PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值(I615/I440)在0～2 min逐渐增加，最后在孵育2 min后达到稳定，由此可以确定PEI-PDs/AuNCs可以对三聚氰胺进行检测.

Time/min图2 PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值(I615/I440)在加入20 μM三聚氰胺后，随孵育时间变化的曲线图

2.3 PEI-PDs/AuNCs对三聚氰胺检测性能分析

为了解三聚氰胺浓度对PEI-PDs/AuNCs荧光强度的影响，向HEPES缓冲溶液(pH为7.4)中加入PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针(其中PEI-PDs质量浓度为15 μg/mL，AuNCs的质量浓度为42.5 μg/mL)，然后分别加入不同浓度三聚氰胺，孵育2 min后，得到三聚氰胺浓度分别为0、0.1、0.5、1、2、3、5、10、20 μM的待测液体，在室温条件下进行荧光测试(激发波长为315 nm)，由图3(a)所示，采用315 nm波长激发，PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针的发射光谱峰位分别在～440 nm和～615 nm，并且在～440 nm处的荧光强度随着三聚氰胺的浓度上升而增加.以615 nm和440 nm 处荧光强度比值(I615/I440)为纵坐标，三聚氰胺的物质的量浓度(C)为横坐标建立PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针对三聚氰胺检测的线性曲线，从图3(b)可以看出，该曲线具体为I615/I440=0.009 92C+1.141 93,440 nm和615 nm处的荧光强度比值(I615/I440)对于三聚氰胺的物质的量浓度(C)的线性响应在 0～20 μM(R2=0.998 66)之间，检测限0.23 μM，说明PEI-PDs/AuNCs对三聚氰胺检测的灵敏性极佳.

Wavelength/nm(a)PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值(I615/I440)随三聚氰胺浓度变化的荧光光谱图

CMe/μm(b)PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针荧光强度比值(I615/I440)随三聚氰胺浓度变化的关系曲线图图3 荧光响应图

2.4 PEI-PDs/AuNCs对三聚氰胺荧光响应的选择性和抗干扰分析

此外，还分析了PEI-PDs/AuNCs对其他相关的物质(离子及氨基酸等)的影响，将这些物质采用超纯水制备成溶液检验PEI-PDs/AuNCs对三聚氰胺的抗干扰性，将20 μM不同的常见离子和天然氨基酸(Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Cl-，NO3-，CO3-，缬氨酸Val ，色氨酸Trp，组氨酸His，甘氨酸Gly，苯丙氨酸Phe，天冬酰胺Asn，蛋氨酸Met，精氨酸Arg，脯氨酸Pro，谷氨酸Glu)分别加入到PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针HEPES缓冲溶液中(其中PEIPDs质量浓度为15 μg/mL，AuNCs的质量浓度为42.5 μg/mL，pH为7.4)，孵育2 min，得到不同离子和氨基酸对三聚氰胺选择性的影响.如图4所示，不同的离子和天然氨基酸对三聚氰胺荧光响应没有显著影响，只有三聚氰胺可以明显地增强该荧光探针的荧光强度.因此我们可以确定该荧光探针对三聚氰胺有很高的选择性且抗干扰性极强，将会是检测三聚氰胺非常有效的一种方法.

图4 PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针对三聚氰胺荧光响应在常见阴、阳离子和天然氨基酸中的选择性分析柱形图

2.5 实物检测

为了测试该比率荧光探针在实际检测中的应用表现，我们选取牛奶为样本，所有的牛奶样品均来自于当地农场.用制备的PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针测试已经去除蛋白质和脂肪的牛奶中三聚氰胺的含量.取3份相同的牛奶样品，加入不同含量的三聚氰胺(2、5、10 μM )，标记为1#～3#，之后加入相同浓度的PEI-PDs/AuNCs溶液(其中PEI-PDs质量浓度为15 μg/mL，AuNCs的质量浓度为42.5 μg/mL).孵育2 min后，进行荧光光谱测试.从表1可以看出样品一中三次检测的三聚氰胺浓度为1.98、1.89和1.97 μM，回收率为97.3%，相对标准偏差为4.93%.检测样品二中三次检测的三聚氰胺浓度为 5.11、5.07和5.13 μM，回收率为102.1%，相对标准偏差为3.06%.检测样品三中三次检测的三聚氰胺浓度为10.09、10.12和10.16 μM，回收率为101.2%，相对标准偏差为3.51%.结果表明回收率在97%～102.1%之间，相对标准偏差(RSDs) 均低于5%，说明PEI-PDs/AuNCs可以应用在实物检测中.

表1 采用PEI-PDs/AuNCs比率荧光探针在牛奶中检测三聚氰胺残留

3 结 论

综上所述，合成了一种聚合物点/金纳米簇比率荧光探针(PEI-PDs/AuNCs)，可以用于三聚氰胺的痕量检测，其制备过程简单、易操作、条件温和、耗时短，并且该比率型纳米荧光探针能够基于两种不同的发射波长的荧光来检测目标物质，利用比率荧光的自校准作用能够有效排除外界干扰因素，因此该荧光探针的灵敏度高，检测结果准确、选择性好、抗干扰性高，同时该比率荧光探针成功地检测出牛奶中三聚氰胺的含量，在实物检测中获得了很好地效果，说明该荧光探针在检测三聚氰胺的领域内具有很好的前景.