不同蛋白酶酶解大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响

韩 丽 彭 翔 严 峰 王海燕 蔡辉益 张广民

（北京挑战生物技术有限公司，北京100081）

大豆皮是大豆经制油、粕后所得的主要副产物，主要由半纤维素和纤维素等组成，具有膳食纤维含量高，水分、霉菌毒素、木质素含量低，可消化程度高，产量大等优势。目前，市场上常用麸皮等作为粗纤维原料用于动物生产中，但麸皮存在含水量高，不利储存，霉菌毒素含量超标，品质不稳定等问题[1]。有研究表明，大豆皮替代麸皮等常规原料，对动物的生长性能无负面影响[2]，并可改善母猪繁殖性能及其健康状况等，还可降低饲料成本等[3]，且其不溶性碳水化合物还具有维持肠道菌群平衡、改善肠道健康等作用[4]。可见，大豆皮可作为一种极好的纤维原料应用于动物生产中。但由于大豆皮含有抗原蛋白等多种抗营养因子，这使其在畜禽生产上的应用受到一定限制[5]。因此，研究与开发利用大豆皮资源新途径，消除其抗营养因子及致敏性，对畜牧业发展具有重要意义。近年来，随着酶制剂应用研究的不断深入，发现豆粕经体外酶解可提高其消化利用率并改善动物生产性能[6]，且在去除抗营养因子方面有着独特的作用[7]，但在豆皮上的研究鲜有报道。因此，筛选适合的蛋白酶对于提高大豆皮的使用价值尤为重要。为此，本试验通过体外酶解试验，评估不同蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶）、不同酶解参数（加酶量、酶解时间、含水量等）对大豆皮抗原蛋白降解效果的影响，以期为提高大豆皮的营养价值和饲用价值提供一定的依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用大豆皮由秦皇岛金海粮油工业有限公司提供；酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶由北京挑战生物技术有限公司提供，其三者酶活力分别为5 万U∕g、5万U∕g、20万U∕g。

1.2 试验仪器

FOSS2300 型全自动凯氏定氮仪，Bio-rad全自动酶标仪，超速离心机，恒温振荡器，粉碎机，过滤筛，精密电子天平（精确到0.000 1 g），封口机，恒温培养箱，烘箱等。

1.3 试验方法

1.3.1 大豆皮基本成分测定

按照GB∕T 6435—2014 的方法进行干物质测定；按照GB∕T 6432—2018 的方法进行粗蛋白测定；按照ELISA检测试剂盒（由北京龙科方舟生物工程技术有限公司提供）说明进行抗营养因子（大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白）的快速定量检测及计算。

1.3.2 酶解样品的制备

在酶解试验中，将一定量不同蛋白酶（100 U∕g）加入一定量的蒸馏水（50%）中混匀，之后全部加入装有300 g 已灭菌大豆皮的发酵呼吸袋内再次混匀，排空袋内气体，封口机封口，并置于恒温培养箱内40 ℃进行酶解，酶解48 h时按照GB∕T 14699.1—2005进行采样，60 ℃烘干并粉碎，过60 目筛，通过试剂盒测定酶解前后大豆皮中球蛋白和β-伴球蛋白含量。

单因素试验涉及酶解大豆皮所用单酶的种类（酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶）、加酶量（25、50、75 U∕g 和100 U∕g）、酶解时间（24、48 h 和72 h）和含水量（40%、45%或50%）的筛选。其中，以加酶量100 U∕g、酶解时间48 h、含水量50%为试验开始时的基础参数，后期试验根据前期试验筛选的结果进行相关单因素调整。每个组3个重复，每个时间点连续采样，酶解结束后，测定酶解产物中球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量，求其平均值，并计算其降解率，进而筛选最优酶解参数。

1.4 数据处理

试验数据用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD 法多重比较，数据均以“平均值±标准误”表示。P＜0.05 表示差异显著，0.05≤P＜0.10表示有变化趋势。

2 结果与分析

2.1 大豆皮中抗原蛋白含量测定

本试验通过测定大豆皮中抗原蛋白含量发现，其球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量分别为28.12 mg∕g和51.69 mg∕g。可见，大豆皮中抗原蛋白含量较高。

2.2 不同蛋白酶酶解大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响(见表1)

表1 不同蛋白酶酶解大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响(%)

由表1 可知，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶解大豆皮48 h 时，其三者球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率差异显著（P＜0.05），分别为40.59%、77.41%和92.62%以及30.46%、52.38%和84.75%。这说明大豆皮中添加酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶可不同程度的降解大豆皮中球蛋白和β-伴大豆球蛋白，且碱性蛋白酶酶解大豆皮抗原蛋白效果较佳，后期试验选择碱性蛋白酶进行酶解工艺优化。

2.3 碱性蛋白酶不同加酶量酶解大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响(见表2)

表2 碱性蛋白酶不同加酶量酶解大豆皮对其抗原蛋白降解效果的影响(%)

由表2 可知，大豆皮中添加50、75 U∕g 和100 U∕g碱性蛋白酶对球蛋白和β-伴大豆球蛋白酶解效果显著优于25 U∕g 碱性蛋白酶添加量（P＜0.05）；其中，当碱性蛋白酶添加量为50、75 U∕g 和100 U∕g 时，其球蛋白降解率分别为91.42%、92.27%和93.54%，β-伴大豆球蛋白降解率分别为82.31%、83.62%和83.94%，对抗原蛋白降解效果相对较好，且三者降解效果差异不明显。因此，考虑成本问题，后期试验将选用加酶量为50 U∕g 碱性蛋白酶进行接下来的酶解工艺优化。

2.4 碱性蛋白酶酶解大豆皮不同酶解时间对其抗原蛋白降解效果的影响(见表3)

表3 碱性蛋白酶酶解大豆皮不同酶解时间对其抗原蛋白降解效果的影响(%)

由表3 可知，通过测定酶解24、48 h 和72 h 时大豆皮抗原蛋白发现，酶解24、48 h和72 h时大豆皮球蛋白降解率分别为74.75%、93.62%和95.34%，β-伴大豆球蛋白降解率分别为50.84%、82.19%和84.56%，且酶解48 h和72 h时大豆皮抗原蛋白降解率显著高于酶解24 h（P＜0.05），而酶解48 h与酶解72 h时豆皮抗原蛋白降解率变化不大，因此选酶解大豆皮48 h进行后期试验。

2.5 碱性蛋白酶酶解豆皮不同含水量对其抗原蛋白降解效果的影响(见表4)

表4 碱性蛋白酶酶解大豆皮不同含水量对其抗原蛋白降解效果的影响(%)

由表4可知，通过测定酶解大豆皮48 h其抗原蛋白含量发现，大豆皮酶解体系含水量为40%、45%和50%时，大豆皮球蛋白降解率分别为92.47%、95.19%和91.12%，β-伴大豆球蛋白降解率分别为82.12%、85.57%和83.29%，其中大豆皮酶解体系含水量为45%时对大豆皮的酶解效果显著优于其他组（P＜0.05）。可见，碱性蛋白酶酶解大豆皮含水量为45%时，其酶解效果较优。

3 讨论

大豆皮中约含12%的粗蛋白，其中免疫原性最强的两种抗原蛋白是β-伴球蛋白和球蛋白，约占大豆皮总蛋白的65%左右，这说明大豆皮中含有相当高水平的抗原蛋白。有报道称，大豆中抗原蛋白可导致动物肠道出现过敏反应[7]，引起肠道损伤，导致动物出现消化功能障碍及动物腹泻等疾病，对畜禽生长造成不利影响[5]。可见，大豆皮直接使用会对畜禽健康造成一定的危害。因此，有必要采取一定的措施，消除其抗原蛋白的抗原性。目前，去除抗原蛋白的方法主要有酶制剂、膨化加工和热乙醇处理法，但由于大豆抗原蛋白属于热稳定抗营养因子，常规的热处理很难将其去除并消除其致敏性。有报道称，蛋白酶对大豆蛋白的体外降解并不总是降低大豆蛋白生物学的致敏性[8]，大豆蛋白的降解是具有蛋白酶特异性的，不同的蛋白酶作用于不同的大豆蛋白亚基或结构[9]。因此，本试验通过对几种蛋白酶对豆皮抗原蛋白降解效果进行评估发现，碱性蛋白酶相比酸性蛋白酶和中性蛋白酶对大豆皮抗原的降解效果较佳。其原因可能与大豆皮在酶解过程中产生胺类等碱性物质，使酶解体系pH 值不断增加，从而导致酸性蛋白酶和中性蛋白酶偏离最适pH 值，使酶活力降低有关。这与前人的研究基本一致[10]。可见，不同蛋白酶作用效果不同，碱性蛋白酶可有效降解大豆皮中抗原蛋白，改善大豆皮的饲用价值。

本试验通过对碱性蛋白酶不同添加剂量对大豆皮抗原蛋白的降解效果进行评价发现，大豆皮中添加不同剂量的此酶，其对大豆皮中抗原蛋白的降解效果不同，即随着碱性蛋白酶加酶量的增加，球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率呈增加趋势；当豆皮酶解体系添加50、75 U∕g和100 U∕g碱性蛋白酶时，其对大豆皮球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解效果相对较优，但三者效果差异不明显，这可能是因为底物量不变，随着加酶量逐渐增加，有利于增加底物与酶结合效率，进而提高抗原蛋白降解率，但当加酶量过大时，底物浓度则相对较低，酶分子饱和，且酶与酶之间可能发生自身水解现象，导致酶对底物的作用减弱，进而导致较高剂量酶对去除抗原蛋白的效率贡献不大，这与前人的研究基本一致[11]。因此，考虑到成本问题，选择碱性蛋白酶加酶量50 U∕g为宜。

酶解时间对蛋白酶酶解效果具有重要的影响，尽可能地在适宜的酶解时间范围内，使蛋白酶发挥最大的作用[9]。本试验通过研究碱性蛋白酶不同酶解时间对大豆皮抗原蛋白酶解效果的影响发现，随着其酶解时间的延长，大豆皮中抗原蛋白降解率不断增加，但酶解48 h 和72 h 时大豆皮抗原蛋白降解率变化不大，这说明在酶解大豆皮48 h 时后，酶解时间对碱性蛋白酶水解大豆皮的影响较小。这可能的原因是随着酶解反应的进行，酶解底物浓度降低，酶反应速度逐渐下降[12]。有报道称，酶解体系含水量的变化对大豆抗原蛋白的降解效果影响显著[9]。本试验通过研究碱性蛋白酶不同酶解含水量对豆皮抗原蛋白酶解效果的影响发现，随着其酶解体系含水量的降低，其酶解效果呈先增加后降低的趋势，且以酶解大豆皮含水量45%为宜。这可能是因为底物含量不变的情况下，随着酶解体系水分含量不断降低，酶作用的底物浓度相对增加，引起酶和底物的结合效率不断增加，酶解反应速度变快，从而影响其对抗原蛋白的酶解效率[13]。

4 结论

在本试验条件下，碱性蛋白酶在降解大豆皮中球蛋白和β-伴大豆球蛋白方面具有重要的作用。其酶解参数为含水量45%、酶解时间48 h、加酶量50 U∕g时，其对大豆皮中抗原蛋白降解效果较好，且提高了大豆皮的饲料利用率和饲用价值。这为利用酶制剂去除大豆皮中的各种抗营养因子以及解决消化吸收利用率低的问题提供了可能性。