不同消毒液对猪场环境消毒效果的研究

骆菲，段晓红，王拴柱，王贵江，罗文学，郭彦军，解冰辉

（河北省畜牧良种工作总站， 河北石家庄050061）

自2018 年8 月2 日辽宁省沈阳市检验出首例非洲猪瘟以来，国内养殖场都饱受非瘟之苦，全国猪存栏量急剧下降，大多猪场都出现了空场或主动减群的现象，如今由于产能的不足， 生猪价格一涨再涨。 猪肉涨价了，幸存下来的猪场收入丰厚了， 风险意识也提高了；遭受非瘟打击的猪场，老板们眼见高利润的生猪价格，也迫切想复养再生产。 但不论是幸存下来的猪场，还是想要复养的猪场，场内环境消毒自然就成了重中之重。

猪场内部环境使用的消毒药及采用的消毒方式多种多样，每种药物及方式在使用后的效果和持续时间都存在不同。 那么猪场该如何根据自身情况来制定合理的消毒方案呢？ 就是我们可以利用实验室检测手段来监测场内环境的消毒效果，通过监测对每次消毒和每次所使用消毒药做出评估，根据每种药物的消毒效果以及消毒方式来制定场内日常消毒方案，使消毒工作既能达到预期效果，同时也不会出现因为重视消毒、恐惧疫病而出现盲目消毒、过度消毒的现象。

1 材料与方法

1.1 采样耗材准备

棉签、医用生理盐水、1.5 毫升离心管、一次性手套、冰袋、记号笔、样品袋、泡沫箱（保温箱）。

注：其中棉签和离心管需要事先经高压灭菌处理，生理盐水尽量使用新开口的医用生理盐水，也可高压灭菌。

1.2 采样时间

消毒前、刚消毒完毕、消毒1～2小时后、消毒4.5 小时后、消毒6.5小时后、消毒16～17 小时后、消毒20 小时后、消毒24 小时后。 注：视情况可以在消毒后选择2～3 个时间段即可。

1.3 样品采集地点

猪舍内的：门口、钢架、窗台、水池边、栏杆、地面、风机、料槽底、漏粪板、水帘、棚顶、喷洒管、墙面、过道等。 注：考虑采样地点如果全部选择会导致工作量巨大，操作时可以在以上项目中选择若干项进行采集。

1.4 样品采集方法

根据事先指定的样品采集方案，在同一样品采集地点的同一位置用灭菌后的棉签（如采样位置干燥需用生理盐水沾湿棉签）粘转一圈， 然后放入灭菌后的装有约0.5毫升生理盐水的1.5 毫升离心管中。

例如： 消毒前在育肥6 舍29池墙面的下墙角采样，消毒后也应在育肥6 舍29 池墙面的下墙角采样。 注：同一采样点的同一位置采样，才能更好的评价消毒药的消毒效果。

1.6 样品采集数量

在每个样品采集地点需采集3个样品，这3 个样品应均匀分布在样品采集地点，不应在样品采集地点的某一部位反复粘转。 例如：墙面这个采样地点需采集3 个样品，棉签粘转的部位应均匀分布在此墙面。 如图所示：图1 为正确采集方法，图2 为错误采集方法。

注： 样品采集既要照顾全面，也要具有科学性，保证每个样品都具有代表性。

1.7 不同消毒药消毒效果比对

不同消毒药的消毒效果的比较可分别在两个猪舍内同步进行，或者在同猪舍不同消毒周期进行。

注：在做不同消毒药效果比对时，两个不同周期的消毒时间与样品采集地点及棉签粘转地点一定要保持一致。

1.8 样品保存

采集完样品立即放置有冰袋的泡沫盒中，尽早寄送至实验室进行检测， 如无法立即送至实验室，或到达实验室后无法立即检测，应将样品放入-20℃冰箱保存。样品如需寄送，放入有冰袋的泡沫盒中密封运输。

2 实验设计

2.1 实验流程

2.1.1 将样品均匀涂布在制备好培养基的培养皿中，放入37℃温箱孵育18～24 小时，菌落读数。

2.1.2 使用营养汤及恒温振荡器增菌，按照实验要求稀释，涂布在制备好培养基的培养皿中放入37℃温箱孵育18～24 小时， 菌落读数。

2.2 实验仪器及耗材

仪器：SPX-250 型智能生化培养箱；恒温振荡器（IS-RDD3）；苏净安泰超净工作台； 高压蒸汽灭菌锅；移液枪（艾本德）；涂布器；锥形瓶（蜀牛）；酒精灯；镊子；培养皿；伊红美蓝琼脂； 营养汤；0.9%生理盐水；10 毫升离心管；1.5 毫升离心管（注意：离心管、培养皿、镊子、锥形瓶等都应高压灭菌后使用）。

2.3 实验操作过程

2.3.1 增菌

制备营养肉汤： 取18 克营养肉汤样品， 加热溶解于1000 毫升蒸馏水中，121℃高压灭菌15 分钟,备用（按需制备）。

分装：将制备好的营养肉汤分装到10 毫升离心管中（每管约2～3毫升）。

加样：用移液枪吸取约200 微升待检样品加到已分装好的离心管中。

培养：将加有样品的离心管放到37℃的摇床进行增菌18～24 小时。

倒板：制备菌落计数培养基（按说明制备即可）。

倒平板：待培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。 其过程是：将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙， 右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖； 待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

注意：倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。 向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。 否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。

2.3.2 样品的稀释

编号：取无菌平皿15 套，分别标 明 为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 各三套，另取6 支1.5 毫升无菌离心管分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。

稀释：在6 支离心管中分别加入180 微升灭菌后的生理盐水，用移液器吸取20 微升已充分混匀的细菌悬液至10-1 离心管中， 此为的菌落平均数，并按下列公式进行计算：

每毫升中菌落形成单位=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×20。

用原样品溶液检测：

倒板（同上）

涂板（同上）

培养（同上）

计数（同上）或长时间湿热的区域。

火碱溶液2∶100： 优点是部分区域消毒更为彻底， 时效性较长，例如：猪舍围栏墙面、猪舍漏粪板、水嘴周围等这些时长时间沾染粪污又不易洗刷干净或长时间湿热的区域，经火碱泼洒浸泡后，有很明显的杀菌效果，并且细菌再滋生的速度也较为缓慢。 缺点是由于是泼洒式消毒，只能覆盖较为低平的10 倍稀释。 将10-1 离心管充分振荡、混匀，吸取20 微升至10-2 离心管中，此为100 稀释，依次类推。

表1 使用戊二醛奎甲溴铵溶液1∶2000 及火碱溶液2∶100 消毒效果检测

2.3.3 涂板

取样： 分别吸取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 的稀释菌悬液各50 微升，对号放入编好号的无菌平皿中。

涂布：用涂布器将滴入平皿中的菌液涂布均匀。

2.3.4 培养

将涂布好的平皿倒置， 放入37℃温箱孵育18～24 小时。

2.3.5 计数

算出同一稀释度三个平板上

3 结果（见表1）

以上结果为某猪场猪舍分别使用戊二醛奎甲溴铵溶液1∶200 及火碱溶液2∶100 消毒效果检测。

通过结果显示，戊二醛奎甲溴铵溶液1∶200： 优点是消毒覆盖面较为全面，例如：风机叶扇、水帘、猪舍钢架、猪舍窗台等半高空卫生死角可覆盖到。 一些钢铁结构的猪舍器械也可覆盖消毒。 缺点是由于是喷雾式消毒，药物雾化后散落在猪舍及器械表面， 风干蒸发后，细菌很快滋生，例如：猪舍围栏墙面、猪舍漏粪板、水嘴周围等这些平时长时间沾染粪污又不易洗刷干净或深凹区域，例如：猪舍窗台、猪舍水帘；由于火碱的强腐蚀性，一些含钢铁结构的区域也不能使用，例如：风机叶扇、猪舍钢架等区域。

4 结论

通过数据可知，再严密的消毒程序也要执行到位，针对不同的消毒区域使用不同的消毒方法和消毒剂，根据消毒剂的灭菌时效确定消毒密度，重点关注消毒死角如风机、钢架等。