藏药三味豆蔻汤散水提物镇静催眠作用研究

李毛加，张金魁，李海丽，南措吉，扎西吉，才让南加*

(1.青海民族大学 药学院，青海 西宁 810007；2.青海省青藏高原植物资源化学重点实验室，青海 西宁 810007)

0 引言

随着生活节奏的加快，人们的生活、工作压力日益增大，导致抑郁、失眠等众多问题.我国成年人群中约有38.2%的人存在失眠症状，约50%的人有过失眠现象[1].大量的失眠症患者伴有不同程度的抑郁、焦虑症状，增加糖尿病、冠心病、老年痴呆症等的患病风险.三味豆蔻汤散是藏医治疗失眠的首选药方，该方最早记载于《四部医典》，由白豆蔻、荜茇和孜然配伍而成，至今有1 300多年的应用历史.索南卓玛[2]等对其进行了初步的临床观察研究，但是尚未见相关药效学研究报道.本文通过三味豆蔻汤散对小鼠自发活动次数影响实验、阈下剂量戊巴比妥钠诱导睡眠实验和阈上剂量戊巴比妥钠睡眠潜伏期实验，探讨三味豆蔻汤散镇静催眠作用，旨在为三味豆蔻汤散的药效评价提供实验数据支撑.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

昆明种小鼠40只，SPF级，体重18～22 g，雌雄各半，合格证号2018003号，购于青海省实验动物中心.饲养于青海民族大学药学院动物房，环境温度：室温(24±2)℃，相对湿度55%～65%，分笼饲养，正常采光.动物饮用纯净水，饲料为实验鼠维持颗粒料(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，适应环境饲养一周，自由摄食与饮水，实验前禁食不禁水12 h.

1.1.2 药品和试剂

三味豆蔻汤散(药物购自青海省藏医院，青药制字Z20122220)，地西泮注射液(规格10 mg/2 mL，哈药集团三精制药有限公司，批号：1801062)，戊巴比妥钠(上海化学试剂采购供应站，批号：1810251).

1.1.3 仪器

ZZ-6小鼠自主活动仪(成都泰盟科技有限公司)，AL204分析天平(梅特勒-托力多仪器上海有限公司)，FA1604电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，JPT-5架盘天平(北京大栅栏天平厂)，SXHW型电热套(河南太康教材仪器厂)，小鼠灌胃器(北京合力科创科技发展有限公司)，一次性使用无菌注射器(规格1mL，山东新华安得医疗用品有限公司，批号：20181023).

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液及试剂的制备

1.2.1.1 三味豆蔻汤散水煎煮药液的制备

依据三味豆蔻汤散临床使用剂量(3 g/人/天，人体重量标准为60 kg)设置了三个剂量组，低剂量组(400 mg/kg)、中剂量组(600 mg/kg)、高剂量组：(700 mg/kg).

称取三味豆蔻汤散0.8、1.2、1.4 g，分别溶于50 mL水中，文火煎煮10 min，配制成低剂量、中剂量、高剂量三组的三味豆蔻汤散水煎煮液.

1.2.1.2 戊巴比妥钠溶液的制备

分别称取戊巴比妥钠40、55 mg 溶于10 mL灭菌注射用水中，配制得40、55 mg/kg的戊巴比妥钠溶液(现配现用).

1.2.1.3 地西泮溶液的制备

取地西泮溶液2 mL，加入20 mL灭菌注射用水中稀释，配制得2.0 mg/kg的地西泮溶液(现配现用).

1.2.2 分组与给药

取50只小鼠随机分成五组，分别为阳性对照组、空白对照组、三味豆蔻汤散低剂量组、三味豆蔻汤散中剂量组、三味豆蔻汤散高剂量组.每组10只，雌雄各半，各药物组小鼠分别按0.2 mL/10 g的给药标准进行灌胃给药，每日1次，连续给药7 d，空白对照组小鼠灌胃等容量生理盐水.

1.2.3 三味豆蔻汤散对小鼠自发活动次数影响实验

测试前将ZZ-6自主活动仪预热30 min.各实验组动物和空白对照组按照相应剂量进行灌胃，阳性对照组在1～6 d期间内灌胃等体生理盐水，第7 d一次性灌胃给予2.0 mg/kg的地西泮溶液(现配现用)，药溶容积为0.2 mL/10 g[3-6].末次给药30 min后将各组小鼠放入ZZ-6自主活动仪内，待小鼠适应5 min后[7]，开始记录小鼠 30、60、90、120 min内活动次数.

1.2.4 阈下剂量戊巴比妥钠诱导睡眠实验

1.2.4.1 戊巴比妥钠阈下剂量的确定

戊巴比妥钠阈下剂量为使90%～100%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠的最大剂量，经预实验确定小鼠戊巴比妥钠阈下睡眠剂量为40 mg/kg.

1.2.4.2 阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡率的影响

实验按1.2.2项下正常灌胃7 d，5个处理组于第7 d给予三味豆蔻汤散30 min后腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠40 mg/kg(临用前现配)，戊巴比妥钠剂量根据小鼠体质量计算(0.1 mL/10 g小鼠体质量)，观察并记录给予阈下剂量戊巴比妥钠后30 min内各组小鼠入睡的只数(以30 min内翻正反射消失达1 min以上者为入睡)，计算各组小鼠睡眠发生百分率(入睡率)[8，9].

入睡率(%)=入睡动物数/动物总数×100%

1.2.5 阈上剂量戊巴比妥钠睡眠潜伏期实验

1.2.5.1 戊巴比妥钠阈上剂量的确定

戊巴比妥钠阈上剂量为使小鼠100%入睡，但又不使睡眠时间过长的剂量，经预实验确定小鼠戊巴比妥钠阈上睡眠剂量55 mg/kg.

1.2.5.2 阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响

实验方法同1.2.4.2项，5个处理组于第7 d给药30 min后腹腔注射阈上剂量戊巴比妥钠55 mg/kg(临用前现配)，戊巴比妥钠剂量根据小鼠体质量计算(0.1 mL/10 g小鼠体质量).以小鼠翻正反射消失为指标，记录小鼠睡眠潜伏期(从给药到小鼠翻正反射消失的时间)与睡眠持续时间(小鼠翻正反射消失至恢复所需的时间)[10-12].

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件，计量资料采用均数标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验.P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 三味豆蔻汤散对小鼠自发活动次数影响实验

为确定三味豆蔻汤散的显效时间，在进行实验前以中剂量(即人临床用药等效剂量)进行了小鼠预实验.发现三味豆蔻汤散的显效时间大概是用药后的60～90 min内，所以实验以小鼠的60～90 min内的活动次数为依据.

表1 三味豆蔻汤散不同剂量对小鼠自主活动的影响(x±s，n=10)

注：与空白对照组相比，*P<0.05；**P<0.01.

如表1所示，与空白对照组相比，三味豆蔻汤散中、高剂量组小鼠的活动次数和站立次数均明显下降，说明该药物对小鼠的自主活动次数有明显抑制作用，其镇静效果明显.高剂量组与中剂量组相比，高剂量组的小鼠的活动次数和站立次数未出现显著下降，两组无显著性差异(P>0.05).

2.2 阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡率的影响

如表2所示，与空白对照组相比，阳性对照组小鼠入睡率明显增加(P<0.01)；三味豆蔻汤散水提物三个剂量组均能不同程度增加戊巴比妥钠阈下剂量小鼠入睡只数，其中三味豆蔻汤散中、高剂量组效果较好.

表2 阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡率的影响(x±s，n=10)

注：与空白对照组(生理盐水)相比，*P<0.05；**P<0.01

2.3 阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期实验

如表3所示，与空白对照组相比，三味豆蔻汤散中、高剂量组小鼠睡眠潜伏期均明显缩短，睡眠时间明显延长，说明三味豆蔻汤散水提物与戊巴比妥钠有协同作用.高剂量组与中剂量组之间小鼠睡眠时间没有显著性差异.

表3 阈上剂量戊巴比妥钠对小鼠睡眠时间的影响(x±s，n=10)

注：与空白对照组相比*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

随着生活节奏的加快，失眠问题困扰着越来越多的人，现代医学治疗失眠的常见药物主要包含苯二氮卓类、非苯二氮卓类、具有镇静作用的抗抑郁药等几种类型，长时间服用易产生依赖性、耐受性、戒断症状、反跳作用等各种不良反应.故从传统医学经典复方和中草药中发现具有治疗失眠功效的药物，对提高人们健康水平显得非常重要.藏医学认为，原发性失眠是由于“三因”中“隆”的偏升而引起，而“隆” 具有“寒”、“轻”、“动”等属性，故通过甘味药和辛味药等具有“热”、“腻”等效能的药物相互配伍来抑制“隆”的“寒”、“轻”、“动”属性.三味豆蔻汤散是以此理论配伍的经典复方，《四部医典》曰：“豆蔻、孜然芹、荜拔三味药研细，用牛奶煎煮成汤，可治疗失眠、不寐”[13].组成三味豆蔻汤散的白豆蔻味辛、苦，荜茇味辛、甘，孜然味甘、辛，依据藏医理论，甘味药具有“重”、“腻”、“钝”等药性，辛味药具有“热”、“锐”等药性，因此三味豆蔻汤散主要以其“热”、“腻”、“重”等药性来抑制 “隆”的“轻”、“寒”等特性来治疗失眠症，这体现了藏医治疗失眠是以平和“三因”为主的理念.

通过对藏药三味豆蔻汤散镇静催眠药效的研究，藏药三味豆蔻汤散可降低小鼠自发活动的次数、增加阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡率，延长阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间，实验结果显示三味豆蔻汤散具有明显的镇静催眠作用.中、高剂量组组间无显著差异，中剂量的给药量与临床常用剂量和《四部医典藏药配方大全》[14]中记载的三味豆蔻汤散的服用剂量大致相同，反映出临床用药剂量的合理性.组成三味豆蔻汤散的三种药中含有桉油精、枯茗醛等挥发油类和胡椒碱、荜茇明宁碱等生物碱类有效成分，据文献报道三味豆蔻汤散中的挥发油及生物碱等都具有抗失眠、抗惊厥等作用[15-18]，充分佐证了藏药三味豆蔻汤散的临床用药合理性，但是三味豆蔻汤散镇静催眠的作用机制有待于进一步深入研究.