分子标志物指导下的结直肠癌精准治疗现状及进展

张 靖 魏少忠

(1. 湖北省肿瘤医院 肿瘤内科， 湖北 武汉 430079； 2. 湖北省肿瘤医院 胃肠外科， 湖北 武汉 430079)

结直肠癌是一种异质性的疾病，疗效及预后差异大。当前，国内外指南仅在少数情况下推荐对结直肠癌行分子标志物指导下的治疗。譬如，对高度微卫星不稳定(microsatellite instability-high，MSI-H)或高突变负荷(tumor mutational burden，TMB)的II期结直肠癌辅助化疗不推荐5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)[1]。围手术期化放疗或辅助化疗主要由肿瘤分期和部位来决定。如何提高辅助化疗的获益风险比一直是临床关注的重点[2]。此外，许多靶向药物已被批准用于晚期结直肠癌一线及以上的治疗，如贝伐珠单抗、雷莫芦单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗及瑞格菲尼等。尽管这些药物明显提高了晚期结直肠癌的疗效，但总体预后仍欠佳(生存期仅约3年)[3]。

近年来，基于肿瘤生物学特征的分子分层治疗，一定程度改善了晚期结直肠癌患者的预后。例如，抗PD-1和抗CTLA-4单抗治疗伴有MSI或高TMB的转移性疾病，以及威罗菲尼治疗伴有BRAFV600E的结直肠癌[4,5]。Dienstmann等[6]指出，结直肠癌的精准治疗将从单基因单药物转变到多基因多药物以及多分子多药物，即从克隆角度转变到克隆-基质-免疫角度，这代表未来结直肠癌的治疗方向。因此，本文就分子标志物指导下的结直肠癌治疗现状及进展做一综述。

1 结直肠癌发病机制

结直肠癌的发生与多种机制相关，阐明该病的发生机制有助于提高患者的疗效及预后。不典型增生腺瘤是结直肠癌最常见的癌前病变，10年以上的病程便转变为结直肠癌[7]。APC基因突变是结直肠癌多步骤发生过程中的早期事件，见于70%以上的结直肠腺瘤。KRAS癌基因的激活和TP53抑癌基因的失活，以及伴随的染色体不稳定(如数目和结构的改变)进一步促进腺瘤恶变[8]。然而，散发性结直肠癌的发生机制及临床特征较为特殊，它好发于近端结肠，常伴有CpG岛甲基化和BRAF基因活化；由于病灶扁平、隐蔽的特征，结肠镜检查常难以发现[9]。遗传性结直肠癌占所有结直肠癌的3%～5%[10]，在胚胎细胞中单个等位基因存在重要的抑癌基因、DNA修复基因失活，以及随后的体细胞突变作为第二次打击，促使另一野生型等位基因功能失调，最终导致肿瘤的发生。遗传性非息肉病性结肠癌(Lynch综合征)和家族性结肠腺瘤性息肉病是由常染色体显性遗传失调及随后的结直肠癌典型基因突变所致[11]。Lynch综合征相关的肿瘤常伴有错配修复缺陷(defective mismatch repair，dMMR)及MSI-H，然而家族性结肠腺瘤性息肉病相关的肿瘤显示了由经典的腺瘤转变至恶性肿瘤的特征[12]。

2 基于MSI与TMB状态的精准治疗

2.1 MSI

MSI由错配修复基因功能缺陷所致。15%的结直肠癌患者伴有MSI，多见于早、中期疾病[13]。散发性病例中，大约2/3的MSI-H由MLH1基因表观遗传失活所致，其他的与Lynch综合征有关，表现为错配修复基因(MLH1, MSH2, MSH6, PMS2)的胚系突变[14]。MSI-H结直肠癌有独特的临床病理特征，如病灶位于近端大肠、分期早(多为II期)、分化差及黏液组织学类型与BRAF突变有关[15]。对早期结直肠癌而言，MSI-H提示预后好；然而，在转移性结直肠癌中，MSI-H可能与预后不良相关。临床前和临床证据表明，MSI结肠癌对5-Fu潜在耐药[16]。因此，NCCN指南对于II期伴有MSI-H和/或dMMR不推荐含5-Fu的辅助化疗[17]。由于III期结直肠癌复发风险较高，当前指南仍推荐含5-Fu的标准辅助化疗方案，而不考虑MSI状态[18]。

MSI-H结直肠癌突变负荷高，产生大量新抗原，进而诱发抗肿瘤免疫反应。机体通过上调免疫抑制信号(如PD-1或PD-L1)抵抗此种反应，避免肿瘤被清除。因此，免疫单抗治疗MSI-H结直肠癌潜在有效。在KEYNOTE-012、016、028、164和158研究中，共入选了包括结直肠癌在内的15种不同类型的MSI-H/dMMR肿瘤(n=149)，化疗进展之后接受pembrolizumab治疗，有效率达39.6%(95% CI：31.7～47.9)，疗效维持1.6～27月，并且78%的有效患者持续时间超过6月[19]。因此，美国FDA批准pembrolizumab用于伴dMMR/MSI-H的不可切除或转移性实体瘤的二线及以上治疗，而不考虑肿瘤病理类型[20]。CheckMate-142研究对74例伴有dMMR/MSI-H的转移性结直肠癌患者一线标准化疗进展后nivolumab的疗效进行评估，发现有效率达31.1%，69%的患者疾病控制超过12周，1年无进展生存(progression free survival，PFS)率和总生存(overall survival，OS)率分别为50%和73%[21]。基于这项研究的结果，FDA批准nivolumab用于伴有dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者的二线及以上治疗[21]。

Mlecnik等[22]发现MSI和微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)肿瘤的免疫基因表达存在显著差别。MSI肿瘤框移突变增加，免疫编辑功能增强，Th1和效应记忆T细胞、原位增殖T细胞和抑制性PD-1/PD-L1阳性细胞密度增加，免疫评分高。多因素分析表明，免疫评分比MSI更能准确预测患者疾病复发及生存[22]。此结果在一项大型的结肠癌队列研究(n=2 681)中得到验证，该研究认为免疫评分预测结肠癌复发风险可靠，建议将免疫评分作为肿瘤TNM-免疫分期的一个新标准[23]。如何进一步筛选免疫单抗获益的结直肠癌亚群患者，值得深入研究。

2.2 TMB

16%的结直肠癌伴有高TMB(定义为每百万碱基大于12个非同义突变)[24]。高TMB在近端大肠癌中更常见，77%伴有MSI-H[18]。MSS的高TMB通常伴有错配修复基因体细胞突变或DNA聚合酶ε基因异常。高TMB与非高TMB结直肠癌的遗传特征不同。APC、TP53、KRAS、PIK3CA、FBXW7、SMAD4、TCF7L2和NRAS是非高TMB结直肠癌最常见的8个突变基因，而ACVR2A、APC、TGFBR2、MSH3、MSH6、SLC9A9和TCF7L2是高TMB结直肠癌最常见的突变基因[24]。尽管高TMB突变率高，但TP53和APC基因在非高TMB肿瘤中更常见。

Lee等[25]研究显示，高TMB疾病有良好预后的倾向，但是，由于患者基线特征不一致，以及病例数有限，此结论仍有待进一步验证。鉴于高TMB能产生较多的新抗原，后者被机体免疫系统识别后激活特异性T细胞反应，从而杀伤肿瘤细胞，因此，TMB是预测免疫治疗效果的一个潜在分子标志物[26]。Lee等[25]分析了516例结直肠癌患者的预后，其中55例(10.7%)患者经检测为高TMB，结果显示高TMB和低TMB患者的5年无复发生存率分别为96.3% 和 79.8%(P=0.005)。Yarchoan等[27]在包括结直肠癌在内的27种肿瘤中分析了TMB与免疫单抗疗效的相关性，表明两者有一定的相关性(P<0.001)。绝大多数(>90%)的转移性结直肠癌表现为MSS或错配修复功能正常(proficient MMR, pMMR)，预期不能从免疫治疗中获益，但有个例报道免疫单抗治疗MSS结直肠癌疗效较好。例如，Gong等[28]报道了1例伴有高TMB的难治性MSS转移性结直肠癌患者接受pembrolizumab(200mg，1次/3周)治疗后，病情评价为部分缓解(partial response，PR)，持续时间达9月以上。

3 基于常见体细胞突变的精准治疗

3.1 RAS

丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路由RAS-RAF-MEK-ERK信号级联组成，半数以上的结肠癌存在该通路点突变，其中40%的突变见于KRAS突变[8]。MAPK是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的下游通路。MAPK通路的活化导致TGFα基因转录，后者是EGFR的配体，从而经自分泌信号环导致抗EGFR药物耐药。基于KRAS、NRAS的基因突变状态来选择西妥昔单抗和帕尼单抗是当前的标准治疗[1]。然而，高达60%的KRAS/NRAS野生型结直肠癌患者对抗EGFR治疗无效[29]。此外，病变原发部位亦影响药物疗效，如右半结肠癌不能从EGFR抑制剂中获益[30]。研究发现，同单一KRAS突变相比，基于MAPK信号通路的野生型和活化型基因分类能更准确预测疗效[31]。表明全面的分子检测有可能提高靶向治疗的有效率。靶向治疗的继发性耐药机制亦与MAPK通路基因突变有关，包括治疗相关的RAS基因突变。

长期以来，临床缺少有效靶向RAS的药物。有研究发现KRAS G12C抑制剂可以使突变的蛋白失活[32]，但在结直肠癌中，KRAS G12C仅占所有KRAS突变的10%，并且KRAS G12C抑制剂的临床疗效尚需等待最终的结果。Sveen等[18]液体活检证实，抗EGFR治疗促使MAPK信号通路基因突变，并导致耐药亚克隆的生长。当停止治疗后，耐药亚克隆水平下降，使得再次给予抗EGFR抗体可能有效。因此，在靶向治疗期间，动态分子检测有助于发现耐药机制以及为治疗方案提供参考[18]。

3.2 BRAF

BRAFV600E突变见于8%～10%的结直肠癌[33]。由于RAS、BRAF基因突变相互排斥，仅在极罕见情况下两者突变共存。BRAF突变与散发性MSI结直肠癌密切相关，后者常表现为侵袭性的生物学特点，对EGFR抑制剂耐药，预后差。另外，单用靶向BRAF的酪氨酸激酶抑制剂疗效欠佳。基础研究表明，治疗失败的原因可能与经MEK信号导致上游基因异常及PTEN-PI3K-AKT通路激活有关[34]。有研究已证实，刺激BRAF突变细胞的EGFR，使得细胞无限增殖，可导致威罗菲尼耐药[29]。联合BRAF和EGFR抑制剂可使部分患者肿瘤缩小，指南已批准BRAF抑制剂和EGFR抑制剂联合化疗(威罗菲尼、西妥昔单抗及伊立替康)用于BRAFV600E突变的难治性、转移性结直肠癌的治疗[35]。这项随机化的II期研究揭示了三药联合组PFS的优势，且有效率达16%，而未接受威罗菲尼治疗的对照组有效率仅4%[35]。目前许多其他的联合治疗方案正在继续探索中，如BRAF、EGFR 和 PI3K三种抑制剂的联合方案。一项小样本的研究发现，BRAF密码子594或596突变结直肠癌与密码子600突变有不同的临床病理特征，并且预后良好，潜在的原因可能与这些突变导致失活突变有关[36]。另一项大型研究亦得到类似的结果[37]。采用二代测序技术检测9 643例转移性结直肠癌标本基因突变状态，其中208例(2.2%)患者伴有非V600E的BRAF突变，其临床特点不同于BRAFV600E突变结直肠癌，男性、低级别病理学类型、原发灶位于左半结肠更多见，中位生存时间在非V600E的BRAF突变、V600E的BRAF突变及BRAF野生型中分别为60.7月、11.4月和43月(P<0.001)[37]。提示对于罕见的BRAF突变可以采用强度更低的治疗方案。

3.3 HER-2突变

在一项212例结直肠癌患者的队列研究中，7%的结直肠癌伴有HER-2基因扩增或体细胞突变，包括激酶区域的突变(如V842I、V777L及 L755S)和胞外区域突变S310F[24]。另一项荟萃分析纳入3 256例患者，结果表明，在KRAS/BRAF野生型的晚期结直肠癌患者中，HER-2基因扩增率达5.2%，并且分期越早，扩增率越低[38]。HER-2功能异常在结直肠癌患者中的预测价值有待进一步研究。体内外研究显示[39]，HER-2信号激活是西妥昔单抗耐药的机制之一。一项回顾性研究表明，西妥昔单抗耐药的RAS/BRAF/PIK3CA野生型患者存在HER-2扩增的现象[40]。

HERACLES-A II期研究[41]评估了K-RAS野生型、HER-2阳性的转移性结直肠癌患者标准治疗耐药后曲妥珠单抗和拉帕替尼联合方案的疗效，应用IHC和FISH分析914例患者标本的HER-2状态，其中48例(5%)诊断为HER-2阳性；在27例入选的患者中，8例(30%)病情缓解，包括1例完全缓解(complete response，CR)和7例PR，中位PFS和OS分别为5.3月和11.5月，1年生存率为45%。MyPathway篮子试验[42]评估了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合治疗HER-2阳性的难治性转移性结直肠癌的疗效，结果显示有效率为38%，中位缓解持续时间为11月，HER-2双重阻断耐受良好，未观察到4～5级毒性。因此，有必要在晚期结直肠癌中常规检测HER-2。在乳腺癌及胃癌中，采用IHC或FISH检测HER-2有相应的标准，但这些标准不一定适用于结直肠癌。在无共识的情况下，建议采纳HERACLES研究中的标准。由于在结直肠癌中无较高循证医学的临床研究支持HER-2双重阻断治疗，已有的临床数据是否能改变治疗决策尚不清楚。

3.4 基因融合(ALK、NTRK、RET、ROS1)

在晚期结直肠癌中，基因融合发生率小于2%，主要包括RET、NTRK、ALK或ROS1融合等[43]。一项研究纳入27例伴有ALK、NTRK、ROS1重排的转移性结直肠癌患者，结果提示重排最常见于右半结肠，且伴有MSI-H、RAS野生型[44]。另一项研究也表明，基因融合常与预后不良及EGFR抑制剂原发耐药有关[45]。

由于伴基因融合的结直肠癌常表现为MSI-H，因而对免疫检查点抑制剂也有潜在疗效。1例伴有EML4-ALK重排和MSI-H结直肠癌患者接受nivolumab单抗单药治疗，疾病取得较长时间的缓解[44]。靶向融合基因的酪氨酸激酶抑制剂已显示初步疗效。在一项篮子试验中，4例伴有NTRK融合的结肠癌患者接受拉罗替尼治疗，3例出现肿瘤退缩[46]。另外，在2例伴有ALK或NTRK1重排的难治性结直肠癌中，ALK/ROS1/泛TRK抑制剂恩曲替尼疗效较好[47]。在1例ALK重排的结直肠癌患者中，色瑞替尼取得了良好的疗效[48]。因此，对于伴有基因融合的结直肠癌，可选用相应的靶向药物。

4 结直肠癌的分子分型

基因表达与细胞表型及肿瘤生物学行为密切相关，已被广泛用于鉴定生物学相同的亚型。基于六项独立的以基因转录组学为基础的亚型系统，国际专家组将结直肠癌分为4个亚型(consensus molecular subtype，CMS)[6]。CMS1亚型在MSI结直肠癌中多见，常伴高突变、高甲基化、免疫细胞浸润(CD8+CTL、CD4+Th和自然杀伤细胞)、免疫激活、JAK-STAT激活及BRAFV600E高突变，提示免疫治疗可能有效。CMS2-4常伴有染色体不稳定。经典型CMS2以MSS、WNT/MYC通路活化、TP53突变、EGFR扩增及过表达为特征，当发生KRAS突变以及其他的基因组改变、代谢失调，便发展成CMS3(代谢适应型)。CMS4(间质型)肿瘤表现为由富于基质的微环境引起TGFβ激活，并作为上皮向间质转化的主要启动因素，激活补体，导致免疫抑制[6,29]。CMS4亚型已被认为与结直肠癌对5-Fu、奥沙利铂及抗EGFR治疗耐药相关[49]。文献报道在人源化CMS4结直肠癌模型中，HSP90抑制剂联合5-Fu有协同作用[50]。基于多基因及多分子改变的结直肠癌分子分型，为应用靶向多个基因及多个分子的联合药物治疗提供了理论基础，值得进一步研究。

总之，基于分子标志物特征指导下的结直肠癌精准治疗将在临床中发挥越来越重要的作用。图1总结了在结直肠癌中当前已获批或潜在的精准治疗。随着对结直肠癌发生、发展机制及各种靶向药物的原发与继发耐药机制的深入研究，精准治疗将进一步广泛实施，并将较大幅度提高患者的预后。