MiR-182对间皮瘤NCI-H2452细胞增殖、凋亡、侵袭的的影响

刘冬冬 李玉婷 李庆海 张才擎 韩伟1,

恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma, MPM)是一种起源于胸膜间皮细胞的恶性侵袭性肿瘤，可发生于胸膜的任何部分，沿胸膜脏层或壁层弥漫性生长，并可侵袭周围组织。由于其恶性程度高、侵袭性强，确诊后中位生存期仅为10～12个月。阐明MPM的病因及发病机制、寻找有效的诊疗措施，成为改善病人预后的重要方向。miR-183家族是近年来研究较为活跃的一类microRNA，作为家族成员之一，miR-182也参与了多种肿瘤的发生、发展[1-3]，但miR-182与MPM发病的相关研究和报道甚少。本文通过体外转染miR-182，观察MPM细胞系NCI-H2452的生物学行为改变，探究其在MPM发病中的作用，为诊治MPM寻求新的靶点。

资料与方法

一、细胞株

本实验所采用的人间皮瘤细胞NCI-H2452系购自武汉普诺赛生物有限公司。

二、miR-182模拟物的构建

miR-182 mimic及NC-mimic由 invitrogen 公司合成。

三、细胞分组

分组：(1) control组，不做转染、完全空白组；(2) miR-182 mimic 组，将 miR-182 mimic 转染NCI-H2452细胞；(3)NC-mimic组，将miR-NC-mimic转染NCI-H2452细胞。

四、miRNA mimic转染

20nM的miR-182 mimic及NC-mimic转染NCI-H2452细胞(按Lipofectamine TM 2000 转染试剂说明书进行)，并分别于转染24小时后收集细胞提取RNA，48小时后进行细胞活力、增殖、凋亡及侵袭等的检测。

五、MTT检测细胞的活力

将3×104的NCI-H2452细胞接种于96孔板，待转染48小时后，吸弃板孔内培养基，加入含10%MTT的完全培养基，然后培养箱中避光孵育1～2小时，使用酶标仪(美国Bio-Tek公司)于450 nm处测定OD值。实验重复3次。

六、流式检测细胞的增殖

细胞转染后经胰酶消化、PBS清洗后，离心收集细胞，并加入PI染液，4℃避光标记30 min，流式细胞仪分析(美国BD公司)上机检测，FCM cellQuest软件计数细胞，Macquit软件分析数据。

七、流式检测细胞的凋亡

细胞转染48 h后，收集细胞，并加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液，室温避光标记15 min，流式细胞仪分析上机检测。

八、Transwell法检测细胞的侵袭

1 细胞准备 在6孔板内转染细胞(方法同前)，转染24h后，胰酶消化、DMEM培养基重悬细胞并计数。

2 配制基质胶 将人工基质胶室温下溶解，并用不含FBS 的DMEM按特定比例稀释，均匀平铺于8 μm 的聚碳酸酯膜上以浸没膜上的微孔，紫外线照射消毒 30 min。

3 转移细胞 将含人工基质胶的小室嵌入24孔板内，下室加入600μL含0.2%FBS的DMEM，上室加入200μL细胞悬液(含5万细胞、0%的FBS)。

4 结晶紫染色 继续培养24h后，用棉签拭去上室面的细胞，95%乙醇溶液固定 30 min，1%结晶紫染色30分钟，在200×显微镜下随机选取 5个视野进行拍照、计数，以上实验重复 3 次。

九、统计学分析

结 果

一、miR-182 mimic可上调的miR-182的表达

在NCI-H2452细胞中转染miR-182 mimic 24h后，miR-182 mimic组中miR-182的表达显著高于对照组(图1，P<0.001)，而NC mimic、Control两对照组间无差异。

图1 RT-PCR检测各组细胞中miR-182的表达

***vsmiR-182 mimic组，P<0.001，n=3

二、上调miR-182对NCI-H2452活力的影响

MTT实验结果显示：miR-182 mimic组中细胞活力显著高于对照组(图2，P<0.001)，而Control、NC mimic两对照组间无统计学差异。

图2 miR-182 mimic对NCI-H2452活力的影响

***vsmiR-182 mimic组，P<0.001，n=3

三、高表达miR-182促进NCI-H2452的增殖

增殖指数=(S+G2M)/(G0G1+S+G2M)*100%，即“G2M+S期”的细胞占全部细胞的比例，与细胞的增殖正相关。细胞周期检测显示：miR-182 mimic转染组在S+G2M期的细胞比例(即增殖指数)较Control组、NC-mimic组均明显增加(图3，P<0.001)，而增殖指数在Control组和NC-mimic组间无差异。

四、高表达miR-182对细胞凋亡的影响

流式检测结果显示：miR-182 mimic组、Control、NC-mimic三组的凋亡无统计学差异(图4)。

五、高表达miR-182促进NCI-H2452的侵袭

Transwell检测结果显示：miR-182 mimic组穿过Transwell小室半透膜的细胞数较对照组明显增多，而每视野侵袭细胞数在NC mimic、Control两对照组间无统计学差异(见图5)。

讨 论

恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一种罕见、恶性程度极高的肿瘤，化疗、放疗、手术等传统方法对MPM患者疗效欠佳。目前发现MPM发病与石棉接触相关[4]，而我国是石棉生产和消费大国，近年来MPM的发病增长迅速，给个人和社会带来了沉重负担。因此，深入阐明MPM的发病机制，对发现该病的新靶点、研发新药具有重要科学意义。

图3 流式检测各组细胞的周期分布

图4 流式检测细胞的凋亡(n=3)

图5 Transwell检测细胞的侵袭

a.结晶紫染色并光镜下拍照评估各组细胞的侵袭能力(200X)；b.不同刺激组细胞在200倍光镜下观察到的每个视野穿透transwell小室的细胞数。** vsmiR-182 mimic组，P<0.01；***vsmiR-182 mimic组，P<0.001(n=3)。

MicroRNA(miRNA)是一类受环境调控的非编码小RNA分子，可通过负性调控下游靶基因的转录而参与多种肿瘤的发生和发展[5]。miR-182是miR-183的家族成员之一，位于人类7q32.2染色体上，研究发现它在不同肿瘤作用的反差很大。其中，miR-182作为癌基因，在肺癌[6]、结肠癌[7]、宫颈癌[8]等肿瘤中发挥促癌作用，但miR-182在MPM中的作用尚未阐明。

Balatti[9]发现，miR-182在MPM细胞系(含NCI-H2452)的表达较人正常间皮细胞明显增加，但其差异表达的意义不明。本人通过转染miR-182类似物上调miR-182，发现可显著提高NCI-H2452细胞的活力、增加进入S期和G2/M期的细胞比例(图2、3)，这说明miR-182可通过调控细胞周期促进NCI-H2452的增殖。类似的是，Chang H发现[10]过表达miR-182可改变H-460(非小细胞肺癌细胞)的周期分布进而促进细胞的增殖。

MPM易发生远处转移，可累及肺、脑、胃肠道等多种器官。本人采用Transwell进行细胞侵袭检测并发现，miR-182过表达组较对照组显著增强了NCI-H2452的侵袭(图5)，提示miR-182在MPM转移中可能发挥重要作用。同样地，Li X等人发现miR-182可促进结肠癌、胃癌细胞的侵袭，进而参与相关肿瘤的转移[11-12]。

本研究通过体外上调miR-182，观察到MPM细胞增殖、侵袭能力显著增强，首次证实miR-182对MPM而言是一种促癌基因。因人力、经费原因，本研究尚有不足之处：1.miR-182在MPM发挥促癌作用的下游机制尚未研究；2.miR-182在人MPM组织的表达情况及miR-182的动物在体实验尚需进一步完善。

综上所述，miR-182在MPM的增殖、侵袭中发挥重要作用，为进一步明确MPM的发病机制和靶向治疗提供了科学依据。