老年晚期肺腺癌患者循环肿瘤细胞变化与临床病理特征及预后的相关性

王玮 叶维洁 王玉树 张为强

我国属全球肺癌高发国家之一，非小细胞肺癌约占全部肺癌的85%～90%，其中肺腺癌相对常见[1]。目前手术仍为早期肺腺癌治疗的首选，但术后患者5年生存率仅为40%～65%[2]。且肺腺癌症状隐匿，较大一部分就诊时已属晚期，丧失外科根治机会，术后复发、转移率高，5年生存率低[3]。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)系自发原因或诊疗过程自原发灶或转移灶脱落进入人体外周血循环或淋巴系统的肿瘤细胞类型[4]。目前越来越多证据显示，CTC是促使癌症转移及复发的高危因素[5-6]。前期已有文献报道，CTC数目与膀胱癌恶性生物学行为密切相关，参与癌细胞浸润过程[7]。也有研究认为通过检测CTC数目可预测胃癌预后[8]。但对CTC检测在肺腺癌诊治方面的报道相对少见。本研究拟通过免疫磁珠法联合免疫荧光原位杂交法检测老年晚期肺腺癌血CTC数目，并探究其与肺腺癌临床病理参数、疗效及预后的关联，以期为老年晚期肺腺癌诊治与预后评估提供依据。

资料与方法

一、 一般资料

收集2017年1月～2018年1月医院收治经病理确诊的老年晚期肺腺癌95例。入组标准：①年龄≥60岁；②经病理确诊为肺腺癌，临床分期Ⅲ～Ⅳ[9]，至少存在1个可测病灶；③入组前未接受抗肿瘤治疗；④无其他器官恶性肿瘤；⑤预计生存期超过3个月；⑥均随访至2019年6月；⑥病例资料完善。排除标准：①心肝肾器质性障碍；②严重脑血管疾病；③合并其他恶性肿瘤；④无法控制严重内科疾病；⑤急慢性感染；⑥自身免疫性疾病、血液系统疾病；⑦临床或随访资料不全。其中男64例，女31例；年龄60～78岁，平均(72.6±7.4)岁；有吸烟史52例；病理分化程度：低分化61例，高、中分化34例；临床分期：Ⅲ期36例，Ⅳ期59例。入选所有对象均获得患者及家属知情同意，经医院伦理委员会审批通过。

二、 方法

1 主要试剂及仪器 CTC试剂盒、免疫纳米磁微粒(Norway Life科技公司)，人淋巴细胞分离液(美国Sigma公司)，鼠抗CK8、CK19、CK20异硫氰酸荧光素标记抗体、抗CD45抗体(美国Abcam公司)，异硫氰酸荧光素标记羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司)，RPMT1640、Tritonx-100(北京赛默飞有限公司)；磁力架(Norway Life科技公司)，离心机(美国Beckman Coulter公司)，恒温摇床(美国STIK公司)，荧光显微镜(日本Olympus公司)，Cell Tracks AnalyzerⅡ分析仪、原位杂交仪(北京赛默飞有限公司)。

2 实验方法 所有晚期肺腺癌患者除表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突变阳性(经证实均为EGFR野生型突变)36例外均接受含铂类双药化疗方案，包括培美曲塞+顺铂45例，吉西他滨+卡铂8例，多西他赛+卡铂6例，均以3周为1个周期，伴EGFR基因突变36例患者先采用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗后再行含铂类双药化疗。化疗前1 d、化疗2个周期后均采集老年肺腺癌病例空腹外周静脉血7 mL，抗凝剂抗凝，血标本采集24 h内以免疫磁珠法联合免疫荧光原位杂交法检测CTC。①免疫磁珠法富集CTC。血样加入等体积磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)试管内混合均匀，加入淋巴细胞分离液4 mL，2 500 r/min离心25 min(室温)，吸取乳白色单核细胞至离心管内，加入等体积PBS混合均匀，1 500 r/min离心15 min(室温)，弃上清，取沉淀单核细胞。磁微粒混悬液(150 μL/份)加入至含1 mL Buffer1(PBS 100 mL+BSA 0.1 g，PH值=7.4)离心管内轻柔吹打混合均匀，磁力架静置60 s，弃上清，PBS洗涤3次，加入50 μl Buffer1重悬磁微粒至150 μL保存备用。单核细胞样本内缓慢加入磁微粒，摇床120次/min共20 min(室温)，加入Buffer2(PBS 100 mL+BSA 0.1 g+2MmEDTA)1mL，600 g离心10 min，弃上清，加Buffer2 1mL重悬，置于磁力架120 s，弃上清，加Buffer1 1mL混匀，加200 μL Buffer3(RPMT1640 100 mL+CaCl2 1 m+MgCl2 5 m，PH值=7.0～7.4)重悬，加4 μl Release Buffer1，室温静置15 min，吹打10～15次，置于磁力架120 s，上清液滴于载玻片，自然风干。②免疫荧光法测定CTC。甲醛(4%)固定30 min(室温)，PBS洗涤5 min×3次，加入Tritonx-100(0.2%)透化3 min，PBS洗涤5 min×3次，BSA(5%)封闭0.5 h，加1% BSA稀释一抗(鼠抗CK8、CK19、CK20异硫氰酸荧光素标记抗体、抗CD45抗体)置于湿盒内4℃过夜，PBS洗涤5 min×3次，加1%BSA稀释二抗(异硫氰酸荧光素标记羊抗小鼠IgG)，37℃避光孵育0.5 h，PBS洗涤5 min×3次，DAPI核染色0.5 h，PBS洗涤5 min×3次，镜下(荧光显微镜)观察CTC阳性情况。

3 CTC阳性标准 参照文献[10]。CK8、CK19、CK20阳性，呈绿色；CD45阴性；DAPI核染，呈紫蓝色；细胞形态完整，体积>4×4 μm2。

4 疗效判定 所有患者每2周期均进行影像学检查评估疗效，参照实体瘤疗效标准[11]。分为完全缓解(complete response，CR；可测病灶消失，持续4周)、部分缓解(partial response，PR；基线病灶长径综合缩小超过30%，至少保持4周)、稳定(stable disease，SD；基线长径总和有所缩小但未达部分缓解标准，或有增加但不及20%)与进展(progressive disease，PD；基线长径总和增加超过20%或有新病灶出现)。

5 随访及预后监测 所有肺腺癌患者随访至2019年6月，出院后每3个月随访1次，半年后每6个月随访1次，以门诊复查或电话随访的方式，以随访时间结束或病情进展或死亡作为观察终点，详细记录所有病例临床病理资料，包括人口学资料、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移、浸润深度、EGFR基因突变及无进展生存期(术后至疾病复发或末次随访时间)等。以病理活检或明确影像学检查存在病灶视为复发。

三、 统计学方法

结 果

一、肺腺癌患者化疗前CTC阳性率

95肺腺癌患者化疗前CTC阳性62例，阳性率为65.26%；化疗2个周期后CTC阳性45例，阳性率为47.37%，与化疗前CTC阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 肺腺癌患者化疗前CTC阳性率比较[n(%)]

二、 肺腺癌CTC阳性率与疗效关系

95例肺腺癌患者化疗2个周期后通过影像学检查评估疗效，其中完全缓解0例，部分缓解31例，稳定52例，进展12例，总缓解率为32.63%；化疗2个周期后CTC数目较化疗前降低58例，不变10例，升高27例。CTC数目减少患者化疗效果等级优于CTC数目不变与增多患者(P<0.05)(见表2)。

三、化疗前肺腺癌外周血CTC阳性率与临床病理特征的关系

不同性别、不同年龄、有无吸烟史肺腺癌患者CTC阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)，临床分期为Ⅳ期、病理分化程度为低分化、浸润范围为T3～T4、淋巴结转移为N3期、存在EGFR基因突变的肺腺癌患者血CTC阳性率高于临床分期为Ⅲ期、病理分化程度为中高分化、浸润范围为T1～T2、淋巴结转移为N0～N2期、无EGFR基因突变的患者，以上数据对比差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表2 肺腺癌CTC阳性率与疗效关系[n(%)]

表3 肺腺癌外周血CTC与临床病理特征的关系[n(%)]

四、CTC阳性、阴性肺腺癌患者无进展生存期比较

所有患者均随访至2019年6月，平均随访时间(13.61±2.72)个月，随访截止日95例患者累积疾病进展19例(20.00%)，CTC阳性患者17例(27.42%，17/62)，阴性2例(6.06%，2/33)，CTC阳性、阴性患者随访截止日无进展生存率分别为72.58%(45/62)、93.94%(31/33)，中位无进展生存时间分别为11.29个月与13.04个月，Log-Rank检验差异有统计学意义(χ2=4.906，P=0.027<0.05)(见图1)。

图1 CTC阳性、阴性肺腺癌无进展生存曲线

五、肺腺癌老年患者无进展生存期影响因素单因素分析

单因素分析显示：肿瘤分化程度、浸润范围、淋巴结转移、CTC、EGFR基因突变为影响老年肺腺癌患者无进展生存期的因素(P<0.05)(见表4、图2～9)。

图2 不同性别肺腺癌无进展生存期比较

六、肺腺癌老年患者无进展生存期多因素分析

多因素Logistic回归分析显示：性别、年龄、吸烟史、肿瘤分化程度与肺腺癌老年无进展生存期无关(P>0.05)。临床分期、浸润范围、淋巴结转移、CTC、EGFR基因突变均与无进展生存期有关(P<0.05)，即临床分期越高、浸润范围越广、伴淋巴结转移、伴EGFR基因突变及CTC阳性肺腺癌患者无进展生存期越短(见表5)。

表4 肺腺癌老年患者无进展生存期影响因素单因素分析(月)

表5 肺腺癌老年患者无进展生存期多因素分析

讨 论

肺腺癌约占全部肺癌的1/2[12]。目前临床公认肺癌术后复发转移与肿瘤微小灶残留(隐匿性转移灶或术后原发灶或淋巴结转移灶残留)有关[13-14]。肺腺癌患者术后或抗肿瘤治疗后大部分癌细胞被机体免疫系统清除，而少部分产生免疫逃逸，在炎症或其他因素刺激下激活，导致癌细胞扩散、转移[15]。

一、 老年晚期肺腺癌CTC阳性情况及与疗效疗效的关系

图3 不同年龄肺腺癌无进展生存期比较

图4 有无吸烟史肺腺癌无进展生存期比较

图5 不同临床分期肺腺癌无进展生存期比较

图6 不同浸润范围肺腺癌无进展生存期比较

图7 不同分化程度肺腺癌无进展生存期比较

图8 不同N分期肺腺癌无进展生存期比较

图9 EGFR基因突变与未突变肺腺癌无进展生存期比较

CTC系自原发灶或转移灶脱落进入外周血液循环的癌细胞类型[16]。国外解剖学报道发现，癌症患者尸体外周血存在与肿瘤原发灶癌细胞相似成分，并首次提出CTC概念[17]。最新研究表明，检测CTC有助于肿瘤相关疾病诊断及预后评定[18]。朱颖等[19]认为，肺癌形成影像学可探测结节性病变时癌灶直径已超过1 cm，而此前患者外周血内已可检出CTC，该观点认为血CTC对肺癌诊断价值更高。近期也有报道表示，外周血检出CTC但胸部影像学阴性病例在随诊5年内皆可发现可切除肺部癌结节[20]。且Xu等[21]指出，肺癌患者血CTC水平与原发灶基因突变存在紧密联系。但对老年晚期肺腺癌CTC检测的作用尚少见报道。本研究对老年晚期肺腺癌病例外周血CTC进行检测，结果发现化疗前老年晚期肺腺癌患者CTC阳性率高达65.26%，表明CTC可能参与肺腺癌发病过程，或可能为肺腺癌癌灶进展或扩散的早期标志物。我们发现在对晚期肺腺癌老年患者进行2个周期化疗后，患者CTC阳性率明显降低，并发现CTC数目较化疗前减少肺腺癌病例大部分均可获得部分缓解或稳定的效果，化疗等级优于CTC数目不变或增多病例，提示CTC数目改变与肺腺癌影像学疗效评估存在一定的关联，或推测CTC有望作为肺腺癌化疗效果预测的依据。但仍有病灶缩小或稳定患者CTC数目增多的情况，考虑癌组织自身具有侵袭及破坏微血管的能力，即便病灶缩小或稳定，病灶内癌细胞仍可通过微血管脱落途径进入外周血循环，造成微转移。故不可笼统将外周血检出CTC增多病例界定为肿瘤进展或转移。

二、老年晚期肺腺癌CTC阳性情况与预后的关系

赵旭东等[22]报道，胰腺导管腺癌患者CTC水平与病情进展及肿瘤恶性生物学行为有关。我们对CTC与肺腺癌临床病理参数关系进行单因素分析发现，CTC与肺腺癌病理分化程度、浸润范围、淋巴结转移情况及EGFR基因突变均密切相关，病理分化程度越低、浸润范围越广且存在广泛淋巴结转移、EGFR基因突变的肺腺癌有更高的CTC阳性率，该结论与Wang等[23]研究结果相似，提示外周血CTC水平可提示肺腺癌病情进展，可敏感反映癌细胞侵袭、转移情况，且可能与EGFR基因突变存在关联。EGFR信号通路对细胞生长、增殖、分化有关键调节作用，且与癌细胞增殖、新生血管生成、肿瘤侵袭及转移紧密有关，是维持癌细胞“永生”的重要原因，一旦发生EGFR基因突变，癌细胞功能持续活化，EGFR表达持续增多，进而促成癌细胞侵袭、转移。

统计发现，超过90%的癌症患者死于癌细胞远处转移[24]。而CTC是癌灶转移的前提，监测外周血CTC水平对监测癌症复发、转移有积极的价值。我们发现，CTC阳性肺腺癌患者无进展生存期低于阴性患者，进行单因素、多因素分析皆证实其为影响肺腺癌无进展生存期的相关因素，与Murlidhar等[25]报道结果相同，证实CTC阳性通常提示老年肺腺癌更差的预后。分析机制可能为：CTC可为癌细胞提供保护，促使其逃逸免疫监视，逃避细胞凋亡；同时CTC相互作用可促进癌细胞存活，且多个癌细胞聚集后与成纤维细胞、内皮细胞、白细胞等结合后形成CTC簇，转移潜能更高，提升癌细胞致瘤潜力，促进其恶性转化，并通过血循环覆盖全身，引起远处转移，导致肿瘤复发，引起不良预后[26]。同时CTC簇形成后可能造成静脉血栓栓塞，进一步加重病情[27]。此外，我们进行多因素分析发现，临床分期、浸润范围、淋巴结转移、EGFR基因突变为老年肺腺癌患者无进展生存期影响因素，考虑癌细胞侵袭性、恶性转化均与以上各因子有关，即临床分期越高、浸润范围越广且伴淋巴结转移、EGFR基因突变的患者癌细胞侵袭性更高，更易呈现恶性表型，复发、转移风险高，预后更差[28]。

故我们得出结论，老年晚期肺腺癌CTC阳性率较高，且CTC水平与肺腺癌病理进展有关，高CTC阳性率通常提示不良预后，其可能通过提高癌细胞侵袭性、促进其恶性表型转化等途径促成肿瘤侵袭、转移，导致不良预后。但本研究样本量较少、观察时间较短，存在一定的局限性，后续需进一步扩充样本量、延长随访时间、多次取样动态检测CTC证实该结论。