微小RNA-195-5p与脑源性神经营养因子在哮喘急性发作期患儿血清中表达相关性研究

林 惠,颜 芬

上海市嘉定区安亭医院儿科(上海 201805)

支气管哮喘是临床中的常见疾病，尤其好发于儿童，也是对儿童影响较大的呼吸道疾病。病变形成中涉及多种细胞因子的改变[1]。微小RNA(miRNA)是一类长度约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，其在多种疾病中可以检测到异常表达。MiRNA是近年关注的与哮喘形成有关的细胞因子[2]，对调控免疫性炎症及炎性因子均有作用。MiRNA的作用主要是通过对靶基因的调控实现的[3]。应用生物信息学对哮喘患儿血清中表达异常的miRNA进行筛选，选择可能表达异常，且罕见报道的微小RNA-195-5p(miR-195-5p)进行研究，并应用TargetScan软件预测其靶基因，选择近年关注较多的且关联性强的脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)进行研究[4]。本实验将探讨miR-195-5p和BDNF在哮喘急性发作期患儿血清中的表达，分析其相关性及临床意义。

资料与方法

1 一般资料 选择2017年8月至2019年6月在我院确诊为哮喘急性发作期的患儿69例作为观察组。病例纳入均符合《儿童支气管哮喘诊断及防治指南》中的诊断标准，患儿伴有突然发生喘息、咳嗽、气促、胸闷等症状，或原有症状急剧加重；发作时双肺可闻及散在性或弥漫性哮鸣音，伴呼气延长。选择确诊为哮喘临床缓解期的患儿69例作为对照组，患儿主要是经过治疗或未经治疗症状、体征消失，肺功能恢复到急性发作前水平，并维持3个月以上。排除标准：①心、肺等器质性疾病引起的喘息；②伴有先天性疾病或自身免疫性疾病；③患儿或家属依从性差者。选择经体检证实为无明显器质性疾病的儿童血清标本69例作为正常对照组。本研究经医院伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》中的要求，家属签属知情同意书。观察组共69例，男38例，女31例，年龄2～14岁，平均(7.4±2.8)岁，首发15例，复发54例(复发次数为2～12次)。对照组共69例，男36例，女33例，年龄3～14岁，平均(7.8±2.1)岁，首发11例，复发58例(复发次数为2～10次)。正常对照组共69例，男35例，女34例，年龄5～14(6.5±2.7)岁。三组在一般资料的比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法

2.1 miR-195-5p的检测：抽取三组的空腹静脉血3 ml，离心(3000 r/min)20 min，留取血清。-80℃冻存。样本均于1个月内集中检测。应用实时荧光定量PCR法(qPCR)检测miR-195-5p的表达。首先提取总miRNA，逆转录合成cDNA。引物上游：5’-TCGAGTCATGTTCACCGGACTG-3’，下游：5’-TCCCACGTGACGACGTCTAT-3’。以U6为内参，引物上游：5’-CACGAGAGAACGCGCATTA-3’下游：5’-GCAGTCATTCAACTCGAATC-3’。引物由苏州睿赢生物技术公司合成。反应程序：50 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共32个循环；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s延伸。在60 ℃时采集荧光信号，记录Ct值，以2-ΔΔCt表示miR-195-5p的相对表达量。

2.2 BDNF的检测：ELISA法检测三组血清中BDNF的含量。试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。严格按实验操作完成检测，用450 nm的酶标仪测量各个孔内的吸光度值，依据OD值，绘制标准曲线，查取对应的BDNF值。

结 果

1 三组中miR-195-5p和BDNF表达的比较 三组中miR-195-5p和BDNF的表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1(图1、2)。

2 观察组不同临床特征中miR-195-5p和BDNF表达的比较 MiR-195-5p和BDNF在观察组不同病变严重程度、是否首次发病的分组中差别有统计学意义(P<0.05)，而在不同性别、年龄的分组中差别无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 三组中miR-195-5p和BDNF表达的比较

表2 观察组不同临床特征中miR-195-5p和BDNF表达的比较

注：与其他组比较，***P<0.05

3 观察组中miR-195-5p与BDNF的相关性 应用Pearson相关分析显示，观察组miR-195-5p和BDNF呈负相关性(r=-0.61,P=0.013,图3)。

图3 观察组miR-195-5p与BDNF的相关性

讨 论

哮喘发病机制与多种因素有关，近年研究认为其发生有免疫机制、遗传机制及神经受体调控机制等[5]。神经受体调控机制认为支气管哮喘是一种由神经调节引起的病变，认为神经肽及神经营养因子等均参与病变的形成。此通路主要表现为肾上腺素能受体失衡，同时神经营养因子的形成和分泌量发生改变，引起神经源性炎症的形成。研究认为当抗原首次进入机体后，T细胞被活化，并激活Th2细胞，经白介素调节后进一步激活B细胞并合成IgE，此过程需要miRNA和BDNF的参与[6-8]，这可能是神经调控机制主要方式。也有研究认为哮喘病变形成时神经元突触传递与可塑性出现明显变化，细胞因子的表达量增加，如BDNF等，由于BDNF受控于多种因子，因此其调控机制涉及多种信号通路的作用，其中就包括miRNA的调节[9-10]。MiRNA是复杂分子调控网络的一部分，其常作为上游因子调控下游靶基因的表达。MiRNA是非编码RNA，其发挥作用的方式主要与靶 mRNA 的 3’UTR 进行结合，使mRNA 的翻译功能发生改变，调节mRNA 下游的靶因子来调控细胞的病理过程[11]。本实验筛选出的miR-195-5p具有调节神经营养因子的作用。MiR-195-5p可能与神经营养因子的调控有关[12]。BDNF是近年关注的与神经调控相关的因子，其在神经细胞中具有保护作用，而在炎性及免疫性疾病时分泌增加，具有对组织和细胞的损伤作用。还有学者认为BDNF可能对激活炎症反应有促进作用[9]。因此机体中BDNF的表达特征与不同疾病有关。BDNF对免疫性炎症的形成有重要作用，可以减少神经细胞的可塑性[13]。

本研究结果显示miR-195-5p在哮喘急性发作期患儿血清中低表达、BDNF在血清中高表达，且miR-195-5p和BDNF在不同病变严重程度、是否首次发病的分组中差异有统计学意义，提示miR-195-5p和BDNF异常表达对病变的形成和进展可能有一定作用。MiR-195-5p低表达、BDNF高表达对预测病变的发生有重要价值，尤其是首次发作时，二者可能是客观指标。MiR-195-5p可能是病变中重要的调控因子。MiR-195-5p在机体中的作用途径可能更多，如减少巨噬细胞和白细胞的吞噬作用，使损伤因子的清除能力下降。巨噬细胞诱发的急、慢性炎症在哮喘中有重要作用，其效应因子是IL-18。哮喘发展过程中可以使局部释放较多的细胞因子，并通过NO依赖途径加速表面上皮和间质细胞的死亡[14]。MiR-195-5p对巨噬细胞的作用通过生物信息学分析也得到间接证实，其靶因子包括CD68和溶菌酶等。本研究显示miR-195-5p与BDNF具有负相关性，提示miR-195-5p与BDNF之间具有负向协同作用，间接证实了生物信息分析的结果，也提示miR-195-5p对BDNF有调控作用[15]。但BDNF是否能作为miR-195-5p的靶点尚需要双荧光素酶等基础实验进行验证。活化后的BDNF对呼吸道上皮的修复和区段的重塑有一定价值，对转录也可能具有一定的调控作用。也有研究认为miR-195-5p表达下降，可以引起细胞内炎性小体的活性增强，伴随着氧自由基的产生，引起局部组织的损伤。

总之，哮喘急性发作期患儿血清中miR-195-5p低表达、BDNF高表达，参与病变的形成，二者具有负向协同作用。