苗药铁筷子不同炮制品中4种成分含量及毒性的比较研究

王雪 王丽 廖秀 王海波 杨娟 李齐激 杨小生

中圖分类号 R927.2;R283.3;R285.5 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）12-1475-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.12.13

摘 要 目的：比较苗药铁筷子阴干、烘干、蒸制、炒炭制品中4种成分的含量及其毒性。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定铁筷子炮制品中东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶的含量。色谱柱为Welch-C18，流动相为乙腈-水（梯度洗脱），流速为1 mL/min，检测波长为214 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。采用改良寇氏法测定铁筷子不同加工炮制品对小鼠的半数致死量（LD50）及其95%置信区间（CI），并评价其急性毒性。结果：东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶检测质量的线性范围分别为0.019～1.856、0.016～1.616、0.009～0.920、0.006～0.624 μg（R 2均不低于0.999 5），精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2.0%（n=6）;平均加样回收率分别为104.49%、102.22%、101.45%、99.26%（RSD均小于2%，n=6）;阴干、烘干、蒸制、炒炭品中，东莨菪苷含量分别为1.119 0%、0.904 3%、1.068 4%、0.036 4%，秦皮苷含量分别为0.867 8%、0.453 9%、0.423 7%、0.020 5%，东莨菪内酯含量分别为0.077 1%、0.155 5%、0.084 4%、0.290 8%，异嗪皮啶含量分别为0.110 2%、0.202 1%、0.208 1%、0.249 4%;4种炮制品的LD50分别为4 118.13、3 733.36、1 643.61、>10 000 mg/kg，95%CI分别为（3 748.87，4 523.76）、（3 422.16，4 072.86）、（1 520.90，1 776.23）、（>10 000）mg/kg。结论：HPLC法重复性、精密度较好，可用于同时测定铁筷子不同炮制品中4种成分的含量;不同炮制品中4种成分均有所差异，2个糖苷类毒性成分的含量明显下降;4种炮制品均为低毒或无毒。

关键词 铁筷子;炮制;含量;急性毒性;糖苷类成分;小鼠

Comparative Study on the Contents of Four Compounds from Different Processed Products of Miao Medicine Chimonanthus nitens and Its Toxicity

WANG Xue1，2，3，WANG Li1，2，LIAO Xiu1，2，WANG Haibo4，YANG Juan1，2，LI Qiji1，2，YANG Xiaosheng1，2[1. State Key Laboratory for Efficacy and Utilization of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550014，China; 2. Guizhou Provincial Key Laboratory for Natural Product Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Guiyang 550014， China; 3. College of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550016， China; 4. Sunflower Pharmaceutical Group （Guizhou） Hongqi Co.， Ltd.， Guizhou Liupanshui 553400， China]

ABSTRACT   OBJECTIVE： To compare the contents  of 4 components and toxicity from Miao medicine Chimonanthus nitens samples after drying in the shade，oven drying， steam， charring. METHODS： The contents of scopolin， fraxin， scopoletin and isofraxin were simultaneously determined by HPLC. The separation was performed on Welch-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 214 nm， and column temperature was 30 ℃， and the sample size was 10 μL. Modified Karber method was used to determine the LD50 and its 95%CI of different processed C. nitens to mice and evaluate its acute toxicity. RESULTS： The linear range of scopolin， fraxin， scopoletin and isofraxin were 0.019-1.856， 0.016-1.616， 0.009-0.920， 0.006-0.624 μg （R2 were all not lower than 0.999 5）. RSDs of precision， stability and reprodu-cibility tests were all lower than 2.0%（n=6）. The average recoveries were 104.49%， 102.22%， 101.45%， 99.26% （all RSDs were lower than 2%， n=6）. The contents of scopolin were 1.119 0%， 0.904 3%， 1.068 4%and 0.036 4%; those of fraxin were 0.867 8%， 0.453 9%， 0.423 7%and 0.020 5%; those of scopoletin were 0.077 1%， 0.155 5%， 0.084 4%and 0.290 8%; those of isofraxidin were 0.110 2%， 0.202 1%， 0.208 1%and 0.249 4%in samples after drying in the shade， oven drying， steam， charring. The LD50 of 4 processed products were 4 118.13， 3 733.36， 1 643.61， >10 000 mg/kg samples; 95%CI were （3 748.87， 4 523.76），  （3 422.16， 4 072.86 ）， （1 520.90，1 776.23），（>10 000）mg/kg. CONCLUSIONS：HPLC method is reproducible and precise. It can be used to determine the contents of 4 components in different processed products of C. nitens. The contents of 4 components in different processed products， and the contents of glycosides toxicity components are decreased significantly. All the 4 processed products were low or non-toxic.

KEYWORDS   Chimonanthus nitens; Processing; Content; Acute toxicity; Glycosides; Mice

铁筷子又名山蜡梅、臭蜡梅、岩马桑和野蜡梅等，为蜡梅科植物山蜡梅（Chimonanthus nitens Oliv.）的干燥细根，全年均可采挖，洗净，阴干，为常用苗药，主要分布于我国贵州省镇远、龙里和贵阳地区[1]。该药收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》《中华本草苗药卷》等专著，具有活血解毒、祛风止痛的功效，可用于治疗疮疖肿毒、跌打损伤、哮喘、劳伤咳嗽、胃痛及风湿痹痛等症[2-4]。铁筷子化学成分主要有挥发油类、生物碱类、黄酮类、香豆素类等[5-6]，药理作用主要集中在止咳化痰、抑菌、抗炎、镇痛、抗肿瘤、清除自由基等方面[7-10]。

中药大多对人体有一定的毒副作用，通过炮制可以达到减毒增效的目的。不同的炮制方法，其解毒原理不同，包括使有毒成分减少、利用辅料解毒、使毒性成分发生转变等。中药加工炮制的历史悠久，产地加工是中药材生产的第一个环节，也是最关键的环节，而炮制是药材成为饮片最重要的一步，合理的产地采收加工及炮制方法是影响药材品质的关键[11]。中药材的产地加工和炮制多遵循古法;时至今日，中药材生产规模加大，其产地加工和炮制也需要产业化，在保证中药材安全有效的前提下，着力提高加工效率。因此，加强对产地加工和炮制技术的研究尤为重要[12-13]。 铁筷子性凉、味辛，有毒，鲜品外用时，可引起皮炎或发疱，服用过量可引起呕吐、腹泻、惊厥，且有中毒案例报道[14]。铁筷子为民间用药，现能查到的炮制方法仅有在《中国民族药炮制集成》中记载的“取铁筷子片置锅中炒黄，加入蜂蜜拌匀炒干，取出晾干”[15]，但该炮制工艺较复杂，操作技术难度大，故有必要寻找新的加工炮制方法，以提高其生产效率，并保证用药安全。本课题组前期对铁筷子化学成分进行了研究[16]，并通过查阅相关文献证实，东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶是其主要活性及质量控制标志成分[17-22]。基于此，本研究以铁筷子不同炮制品（阴干、烘干、蒸制、炒炭）为对象，通过高效液相色谱法（HPLC）比较不同炮制品中东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶等4种成分的含量差异，并探讨其毒性变化，为该苗药的质量控制和临床应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

1260 Infinity型HPLC仪（美国Agilent公司）;FA2004N型万分之一电子分析天平（上海菁海仪器仪表有限公司）;SB25-12DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;OSB-2100型水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）;101型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 藥品与试剂

苗药铁筷子阴干品（为专著[2-3]收录品种，批号：20181108-1，编号：S1）、烘干品（批号：20181108-2，编号：S2）、蒸制品（批号：20181108-3，编号：S3）、炒炭品（批号：20181108-4，编号：S4）均由葵花药业集团（贵州）宏奇有限公司提供，经贵州中医药大学药学院陈德媛教授鉴定为蜡梅科蜡梅属植物山蜡梅（C. nitens Oliv.）的根。

东莨菪苷对照品（批号：D-062-180229，纯度：≥98%）、秦皮苷对照品（批号：Q-033-181015，纯度：≥98%）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司;异嗪皮啶对照品（批号：110837-201608，纯度：≥98%）、东莨菪内酯对照品（批号：110768-200504，纯度：≥98%）均由中国食品药品检定研究院提供;以0.9%氯化钠溶液作生理盐水用;乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为纯净水。

1.3 动物

初成年未交配的SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK （辽）2015-0001。明暗周期为 12 h;所有小鼠均自由饮水和进食，适应性饲养观察 1 周后开始试验。

2 方法与结果

2.1 铁筷子不同炮制品中4个主成分的含量测定

采用HPLC法测定。

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Welch -C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～10 min，7%A→9%A;10～20 min，9%A→12%A;20～30 min，12A%→20%A;30～40 min，20%A→30%A;40～50 min，30%A→55%A;50～60 min，55%A→75%A;60～70 min，75%A→95%A）;流速：1 mL/min;柱温：30 ℃;检测波长：214 nm;进样量：10 μL。

2.1.2 混合对照品溶液的配制 取东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶对照品各适量，精密称定，加80%甲醇溶解，制得每1 mL含东莨菪苷0.185 6 mg、秦皮苷0.161 6 mg、东莨菪内酯0.092 0 mg、异嗪皮啶0.062 4 mg的混合对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品和空白对照溶液的配制 精密称定“1.2”项下铁筷子不同加工炮制品，粉碎。取上述粉末1 g，置于250 mL圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇100 mL，称定质量，回流提取2 h，放冷，再次称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。以80%甲醇作为空白对照溶液。

2.1.4 系统适用性考察 精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液、“2.1.3”项下供试品和空白对照溶液各10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。结果，各待测成分的分离度均大于 1.5，理论板数以秦皮苷计不小于 40 000。

2.1.5 线性关系考察 分别取“2.1.2”项下混合对照品溶液2 mL，置于2、5、10、25、50、100、200 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，混匀。取上述溶液各适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

2.1.6 精密度试验 取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶峰面积的RSD分别为0.84%、0.62%、0.52%、0.58%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取“2.1.3”项下铁筷子药材阴干品供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶峰面积的RSD分别为1.39%、1.39%、0.54%、1.84%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 取铁筷子药材阴干品粉末适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按标准曲线法计算含量。结果，东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量的RSD分别为0.59%、0.41%、1.37%、0.69%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 精密称取已知含量铁筷子药材阴干品粉末0.5 g，共6份，加入与已知含量等量的东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.1.10 样品含量测定 精密称取“1.2”项下铁筷子不同炮制品各适量，粉碎，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并按标准曲线法计算各样品中4种成分的含量。每样品平行操作3次。结果，与阴干品比较，烘干品、蒸制品、炒炭品中东莨菪苷、秦皮苷含量均下降，而东莨菪内酯、异嗪皮啶含量均升高;炒炭品中4种成分含量的变化较明显，详见表3。

2.2 铁筷子不同炮制品急性毒性实验

2.2.1 小鼠急性毒性预实验 根据《食品安全国家标准急性经口毒性试验》[23]进行实验，药物剂量参考文献方法[24-25]。取昆明小鼠130只，随机分为空白组，阴干1、2、3组，烘干1、2、3组，蒸制1、2、3组，炒炭1、2、3组，每组 10 只，雌、雄各半。禁食不禁水12 h后，空白组小鼠灌胃生理盐水0.4 mL/10 g;各给药组小鼠单次灌胃相应药物，组间剂量比为 1 ∶ 0.5。给药后，常规饲养，连续观察 7 d，记录各组小鼠死亡情况，结果见表4。由表4可见，阴干、烘干、蒸制组铁筷子引起昆明小鼠100%死亡的剂量（Dm值）分别为6 000、6 000、2 353 mg/kg;当给药剂量>10 000 mg/kg时，炒炭组小鼠未出现死亡。

2.2.2 铁筷子不同炮制品急性毒性实验 选取小鼠240只，随机分为空白组、阴干1～7组、烘干1～7组、蒸制1～6组、炒炭1～3组，每组10只，雌雄各半。根据预试验中阴干、烘干、蒸制组铁筷子引起昆明小鼠100%死亡的剂量，参考文献[24-25]及按改良寇氏法[26]设置药物剂量，阴干组、烘干组、蒸制组组间剂量比值确定为1.0 ∶ 0.85;炒炭组在预实验中未出现死亡，故将该组组间剂量比值确定为1.0 ∶ 0.5。禁食不禁水12 h 后，空白组小鼠灌胃生理盐水0.4 mL/10 g，阴干1～7组小鼠分别单次灌胃2 263、2 662、3 132、3 685、4 335、5 100、6 000 mg/kg，烘干1～7组小鼠分别单次灌胃 2 263、2 662、3 132、3 685、4 335、5 100、6 000 mg/kg，蒸制1～6组小鼠分别单次灌胃1 044、1 228、1 445、1 700、2 000、2 353 mg/kg，炒炭1～3组小鼠分别单次灌胃2 500、5 000、10 000 mg/kg。连续观察14 d，记录各组小鼠的死亡情况，结果见表5。根据14 d内各组小鼠死亡率，按改良寇氏法[26]基本公式（公式①）计算半数致死量（LD50）;按公式②③计算小鼠LD50的95%置信区间（CI）。根据世界卫生组织（WHO）外源性化学物毒性分级标准评价铁筷子不同加工炮制品相对毒性[23]。

式中，Xm表示最大剂量组剂量的对数，i表示相邻两组给药高剂量与低剂量之比的对数，p表示各组小鼠的死亡率（用小数表示），∑p表示各组小鼠死亡率的总和，FL是LD50的95%CI，Sx50是LD50的标准误，q表示每组小鼠的存活率，n表示每组小鼠數。

结果，铁筷子阴干、烘干、蒸制、炒炭品的LD50分别为4 118.13、3 733.36、1 643.61、>10 000 mg/kg，与阴干品比较，烘干、蒸制处理后，铁筷子的毒性略增加，但都属于低毒;而炒炭后，铁筷子为实际无毒，详见表6。

3 讨论

3.1 提取方法与色谱条件的选择

本研究采用超声、加热回流进行提取，并考察了不同体积分数甲醇的提取效果。结果发现，以80%甲醇加热回流提取2 h时，4种待测成分的提取率均较高。本研究对不同流动相（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水）的分离效果进行考察。结果发现，采用乙腈-水进行梯度洗脱时，各待测成分的分离度良好，峰形较佳。另外，将样品进行全波长扫描，最终选择214 nm作为检测波长。

3.2 铁筷子经不同方法炮制后4种成分含量的变化

铁筷子阴干、烘干、蒸制、炒炭品中东莨菪苷、秦皮苷、东莨菪内酯、异嗪皮啶含量有所不同。与阴干品比较，烘干、蒸制、炒炭品中东莨菪苷、秦皮苷含量均有不同程度下降，东莨菪内酯、异嗪皮啶含量均有所升高。其中，以炒炭法含量变化最为明显，东莨菪苷下降96.75%，秦皮苷下降97.64%，东莨菪内酯增加277.17%，异嗪皮啶增加126.32%。研究显示，单糖苷的热稳定性差，经过加工炮制（如烘干、蒸制、炒炭等）后单糖苷苷键会发生断裂，苷含量会降低 [27]。东莨菪苷、秦皮苷系单糖苷，加工炮制后，含量降低。东莨菪内酯是东莨菪苷的苷元，经加工炮制后苷键断裂，苷元增加;而异嗪皮啶含量增加，可能是由于秦皮苷发生苷键断裂后接上了甲基有关。

3.3 炮制对铁筷子急性毒性的影响

根据WHO外源性化学物毒性分级标准，铁筷子阴干品、烘干品、蒸制品属于低毒，而炒炭品属于实际无毒。有文献报道，东莨菪苷对神经细胞具有一定毒性，且随着剂量增加而增强[17];秦皮苷可致镇静、惊厥、昏迷，甚至呼吸麻痹而死[19]。炒炭后铁筷子毒性降低或与糖苷类的含量有一定关联，但具体原因有待进一步研究。

综上所述，本研究建立的HPLC法重复性、精密度较好，可用于测定铁筷子不同炮制品中4种成分的含量;与阴干品比较，经烘干、蒸制、炒炭后，铁筷子中4种成分含量有所变化，2个糖苷类毒性成分含量明显下降;炒炭品无毒。

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（收稿日期：2019-12-19 修回日期：2020-04-22）

（编辑：段思怡）