外源激素处理接穗对海南油茶高接换冠的影响

张 健，叶天文，陈 雅，李艳民，王笃雄，罗 健，袁德义

（1.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004； 2.澄迈乐香种苗管理有限公司，海南 澄迈 571900）

油茶是我国特有的木本油料树种，也是海南岛的传统植物资源，海南岛特有的气候环境条件孕育了丰富而具有特色的油茶资源。海南种植油茶历史悠久，品质优良，所产茶籽油的口感与品质有别于内地，茶油具有独特的香味，在当地被称为“山柚油”，价格较为昂贵[1]。但海南省油茶产业的发展十分滞后，其主要原因是缺乏优良品种，尤其是长期使用实生苗造林，导致品种退化严重，产量低；同时经营管理方式粗放，大多处于半野生和原始栽培状态，形成了大面积的低产林[2]。本课题组自承担国家林业公益性行业科研专项以来，对海南特色油茶种质资源进行了深入调查研究[3-4]，并于2016年选育出‘海油1 号’ ‘海油2 号’‘海油3 号’‘海油4 号’4 个品种，为海南油茶种质资源的开发利用和产业发展提供了优良品种。现阶段亟待运用嫁接技术进行新品种的扩繁来改善海南地区油茶低产的现状。

大树高接换冠是较为便捷高效的经济林树种无性系改造方法之一。应用该方法进行经济林树种的改造，不但成活率高，而且2 a 恢复树势，3 a可挂果，5 a 即能达到丰产，是油茶优良品种推广、低产林改造的关键技术[5]。愈合是嫁接成活的首要条件，接穗能否成活，取决于砧穗能否产生愈伤组织，快速连接并分化出形成层及输导组织[6]。在植株嫁接愈合过程中，愈伤组织的分化、产生及其延伸速度是决定愈合时间的一个关键因素，外源激素在嫁接愈合过程中起着非常重要的调节作用。利用外源激素处理接穗在核桃[7]、枣树[8]、白玉芒[9]等树种的嫁接方面均有相关研究，但在油茶嫁接方面的应用仅有少量报道。郑碧娟等[10]以100、200、300 mg/L 的KT 溶液浸泡油茶芽苗砧接穗，研究KT 处理后的油茶芽苗砧接穗对其嵌合体发育的影响，结果表明接穗经低浓度KT 浸泡后再进行嫁接，有利于嵌合体的愈合及成活率的提高。苏丽芳等[11]在研究外源IAA 对油茶芽苗砧嵌合体愈合的影响试验中发现，外源IAA 的使用使油茶芽苗砧嵌合体的各项生理指标发生了变化，加剧了愈合过程中可溶性糖和可溶性蛋白含量的变化，也使嫁接苗体内保护酶活性发生变化，使愈合的关键时期提前。本试验中以海南本地实生播种的8年生油茶树为砧木，将接穗用外源激素处理后进行嫁接，探究外源激素对油茶高接换冠的影响，以确定外源激素的最佳应用浓度和处理方式，为油茶良种繁育和生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地在海南省澄迈县福山镇中南林业科技大学教学实习基地。该基地位于北纬19°56′45″、东经109°45′56″，属热带季风气候，长夏无冬，热雨同季，年平均气温23.8 ℃，土壤为赤红壤，pH5.0 ～5.5，且富硒程度高，具备栽培油茶的优良环境[12]。

1.2 试验材料

以该基地海南本地实生油茶苗造林的8年生油茶树为砧木，株行距为3 m×4 m，嫁接前 1 个月对试验地进行垦覆清理，同时对树体进行整形定干，每棵树选留4 ～5 个分枝角度适合、干直光滑、无病虫害的主枝，其余枝全部从基部剪除。嫁接高度控制在60 ～70 cm，嫁接部位砧木直径控制在20 ～30 mm。接穗采自该基地2017年营建的采穗圃，接穗品种为‘海油3 号’，选取发育健壮、芽眼饱满的当年生半木质化新梢为接穗。

1.3 试验方法

2018年8月，采用L9(34)正交试验法进行试验，各试验因素及其水平见表1，正交设计方案见表2。以无处理为对照，共10 个处理组合，每个处理嫁接30 个接穗，3 次重复。

表1 以外源激素处理海南油茶接穗的试验因素与水平Table 1 Factors and levels in the using exogenous hormone treat C.hainanica scions test

在3 种处理方式中，速蘸和浸泡均在削穗后进行，嫁接时将配制好的溶液倒于干净的塑料盆中，将削好的接穗切面浸在溶液中。由同一人员采用插皮接的方法进行所有嫁接操作。接后绑保湿罩，并用上部剪有小口的信封进行遮阴。按照常规方法统一进行田间土肥水管理，做好病虫害防治和除萌。

1.4 测量指标与方法

1.4.1 愈伤组织形成率调查

嫁接后，每隔5 d 观测嫁接口愈合情况，统计砧穗结合部位产生瘤状愈伤组织的接穗数量。愈伤组织形成率=愈伤组织形成数/嫁接数×100%。

1.4.2 成活率和抽梢率调查

嫁接50 d 后调查嫁接成活率和抽梢率。接穗芽眼仍然青绿则视为嫁接成活，芽眼发黑干枯则为嫁接失败。成活率=成活数/嫁接数×100%。芽眼萌动且新梢长度大于2 cm 视为抽梢，抽梢 率=抽梢数/嫁接数×100%。

1.4.3 枝条生长量测量

嫁接60、120 d 后调查新梢生长量，新梢长度采用卷尺测量，新梢直径采用游标卡尺测量。

1.4.4 生理生化指标测定

嫁接65 d 后，将各处理已抽梢的枝条随机剪取10 枝，每枝条选取3 片叶，用剪刀剪下，放入塑料袋内，并立即装入冰盒中，带回实验室后置于超低温冰箱中保存，用于各生理生化指标的测定。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250 染色法测定。可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定。叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用硝基四唑蓝还原法，过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用过氧化氢法[13]。

1.5 数据处理

所得试验数据采用Excel 2016 和SPSS 21.0 软件进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对嫁接成活和抽梢的影响

通过试验发现，使用不同种类和浓度的激素采用不同方式处理接穗对嫁接成活率及抽梢率影响较大。使用激素处理接穗后的嫁接成活情况见表2。由表2 可知，处理1、2、5、8 的成活率和抽梢率均高于对照，其中处理1 的效果最好，成活率比对照高12.22 百分点，抽梢率比对照高26.67 百分点。从K值来看，10 组处理对嫁接成活率和抽梢率的影响一致，最佳组合为A1B1C1（用50 mg/L NAA 速蘸接穗），与试验结果相符。通过R值可以看出，对接穗成活及抽梢影响最大的是因素B（激素浓度），其次为因素C（处理方式）。从试验结果来看，选用的3 种激素均可在一定程度上促进嫁接成活及抽梢，但不同激素的最适应用浓度不同。本试验中结果表明，50 mg/L GA3对油茶嫁接具有促进作用，作用效果仅次于50 mg/L NAA，成活率为93.33%，抽梢率为80.56%，与唐辉等[14]发现GA3对银杏嫁接成活具有抑制作用的试验结论不同。但250 mg/L GA3处理接穗对嫁接成活抑制作用明显，嫁接成活率比对照低43.34 百分点，抽梢率比对照低48.88 百分点。可见不同浓度的GA3处理对油茶嫁接的影响也不同。对因素C（处理方式）的试验结果进行差异显著性检验 （表3），C1与C2的嫁接成活率和抽梢率差异达极显著水平，C2与C3仅成活率有显著差异，因此在使用激素处理接穗时，时间不宜过长，速蘸1 ～ 2 s 即可。

表2 以外源激素处理海南油茶接穗试验的正交设计及嫁接成活和抽梢情况Table 2 Orthogonal design, grafting survival and shooting status in the using exogenous hormone treat C.hainanica scions test

表3 C 因素各水平海南油茶嫁接成活率和抽梢率的差异显著性比较†Table 3 Signifciance comparison of differences between grafting survival rates and shooting rates in C.hainanica at each level of C-factor

2.2 不同处理对嫁接口愈合情况的影响

不同处理对油茶嫁接愈合过程中愈伤组织的形成影响显著（图1）。除处理7 外，其他处理均在嫁接10 d 时开始愈合，至嫁接40 d 时愈伤组织形成率达到最大。其中，处理1、2、4、5、8 的愈伤组织形成率高于对照，处理1（50 mg/L NAA速蘸）的效果最好，嫁接40 d 时愈伤组织形成率为97.89%，比对照高10.11 百分点。可能是由于NAA 通过抑制隔离层的形成并促进形成层活动，促使细胞分裂与扩大，从而加快砧穗愈合速度，加快了愈伤组织的形成[15]。处理7（250 mg/L GA3喷施）的效果最差，愈伤形成率仅为46.67%，比对照低41.11 百分点，可见高浓度的GA3处理对嫁接口愈伤组织的形成具有一定的抑制作用。

图1 不同处理对海南油茶嫁接口愈伤组织形成的影响Fig.1 Effect of different treatments on interface callus formation in C.hainanica

2.3 不同处理对枝条生长量的影响

分别在嫁接60、120 d 时测量枝条生长量，发现不同处理的枝条生长量存在显著差异（表4）。处理1、8 的枝条生长量显著高于CK，其中处 理1（50 mg/L NAA 速蘸）的枝条生长量最大，嫁接60 d 时的枝条长度为12.51 cm，直径为 3.30 mm；嫁接120 d 时的枝条长度为64.56 cm，直径为6.35 mm。处理2、4、5、6、9 与CK 差异不显著，处理3（250 mg/L NAA 浸泡）和处理7 （250 mg/L GA3喷施）的枝条生长量显著低于CK，其中处理7 的枝条生长量最小，嫁接60 d 时的枝条长度为4.03 cm，直径为1.90 mm；嫁接 120 d 时的枝条长度为23.16 cm，直径为4.35 mm。

2.4 不同处理对叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量的影响

可溶性糖和可溶性蛋白是叶片光合作用的主要产物。使用不同浓度外源激素处理接穗，对接穗新梢叶片的可溶性蛋白和可溶性糖含量有显著影响，不同处理对叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量影响不同（表5）。处理1、4、5、6、8 的叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量较CK 均有显著提高。其中处理1（50 mg/L NAA 速蘸）的效果最好，叶片可溶性蛋白含量为15.26 μg/g，较CK 提高30.09%，可溶性糖含量为15.85%，较CK 提高29.07%。处理2、7、9 的叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量均低于CK，其中处理7（250 mg/L GA3喷施）的叶片可溶性蛋白含量最低，较CK 降低19.86%；处理9（150 mg/L GA3速蘸）的叶片可溶性糖含量最低，较CK 降低26.55%。

表4 不同处理对油茶新梢生长量的影响Table 4 Effect of different treatments on new shoot increment in C.hainanica

表5 不同处理对海南油茶叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量的影响Table 5 Effect of different treatments on contents of soluble protein and soluble sugar in C.hainanica leaves

2.5 不同处理对叶片保护酶活性的影响

在植物嫁接愈合过程中，植物激素通过影响砧穗的生理生化性质以及组织结构分化等，影响砧穗间的嫁接亲合性，SOD、CAT、POD 活性是衡量植物抗性的主要指标[16]。在对接穗新梢叶片进行理化性质分析后发现，不同处理对叶片酶活性的影响不同（表6）。枝条生长量得以提高的处理中，叶片保护酶的活性较CK 有显著提高。处理1（50 mg/L NAA 速蘸）中叶片3 种保护酶活性最高，较CK 分别提高153.14%、78.63%、43.99%。使得POD 活性增加的为处理1、2、4、5、8；使得SOD 酶活性增加的为处理1、2、4、5、6、8；使得CAT 酶活性增加的为处理1、2、4、5、6、8。说明适当浓度的外源激素的使用提高了油茶嫁接后的生理抗性，为枝条的生长提供了有利条件。处理3（250 mg/L NAA 浸泡）、处理7（250 mg/L GA3喷施）、处理9（150 mg/L GA3速蘸）的叶片保护酶活性均较CK 显著降低。

表6 不同处理对油茶叶片保护酶活性的影响Table 6 Effects of different treatments on activities of protective enzymes in C.hainanica leaves

3 结论与讨论

试验结果表明：使用适当浓度的外源激素处理接穗后再进行嫁接，有效提高了嫁接成活率和抽梢率，并促进枝条生长。在使用外源激素处理接穗时，处理时间不宜过长，速蘸1 ～2 s 即可，接后喷施和浸泡15 min 的效果不明显。采用50 mg/L NAA 处理接穗的效果最好，其次为50 mg/L GA3和250 mg/L IAA；50 mg/L NAA 处理接穗且嫁接60 d 时，其枝条长度为12.51 cm，直径为 3.30 mm；嫁接120 d 时枝条长度为64.56 cm，直径为6.35 mm，显著高于对照。高浓度的GA3处理接穗后对嫁接成活和新梢生长具有明显的抑制作用。通过对新梢叶片进行理化性质分析后发现，不同处理对叶片的影响不同，枝条生长量得以提高的处理，其叶片可溶性蛋白和可溶性糖的含量及3 种保护酶的活性较CK 有显著提高。由于外源激素的使用直接促进了愈伤组织的形成，使砧穗连接的维管束形成时间缩短，较未采取处理的对照组愈合快、成活早，对枝条生长具有前期优势，同时外源激素的应用对植株内源激素也有一定的诱导作用，在一定时间内可促进砧穗的物质交流和营养运输，使嫁接苗生长速度加快[17]。

愈伤组织的形成是植物嫁接成活的关键，而嫁接口愈伤组织的形成受到多种因素的影响[18]。在生产中使用生长调节剂来处理葡萄、苹果、核桃等的接穗或砧木，均有促进愈合的作用[19-21]。 傅远志等[22]在水杉异砧嫁接中发现，内源激素GA3的含量有显著的峰值。还有研究指出，用IAA 和KT 的混合物处理接穗，可以促进形成层活动，产生大量愈伤组织，形成维管束桥[23]。周乃富等[24]使用石蜡切片技术观察核桃嫁接愈合过程，发现愈伤组织依次分化形成导管和形成层，并由新形成层进一步分化产生木质部组织来完成砧穗维管组织的连通，愈合时间短，嫁接成活率高。

在本研究中，使用适宜浓度的外源激素处理接穗后，对嫁接口愈伤组织的形成起到了一定的促进作用，这可能是由于NAA、IAA、GA3有利于细胞的生长，促进了形成层细胞的活化，增加了植体内多种酶的活性，促进接口周围的细胞快速生长和分裂，从而加快愈伤组织的形成[25]。使用高浓度的IAA 处理接穗取得了较好的效果，可能是由于促进了乙烯含量的增加，从而提高萌芽力和嫁接成活率。高浓度的GA3抑制维管束的形成。本试验结果表明，250 mg/L GA3处理油茶接穗后嫁接成活率比对照低43.34 百分点，抽梢率比对照低48.88 百分点，验证了其对油茶嫁接亲合性有一定的抑制作用。相关研究结果表明，使用低浓度GA3处理接穗对嫁接成活及枝条生长有较好的促进作用，高浓度处理有抑制作用[26-27]，这与本研究中所得结论一 致。李瑞高[28]分别用1.0×10-4、2.0×10-4、3.0×10-4的萘乙酸浸泡枝条基部24 h 后进行嫁接，对嫁接成活率没有影响，与本试验中所得结果有所不同，这可能与处理方式和处理时间有关。

崔克明[29]通过试验证明，5 类植物激素（生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯）均参与了形成层通过平周分裂或斜向横分裂增加自身和向内形成木质部、向外形成韧皮部的过程。卢善发等[30]经研究发现，植物激素通过影响砧木和接穗间维管束桥形成的时间和数目来调控嫁接体的发育，参与接穗和砧木间愈伤组织的产生和维管束桥的分化等。

通过试验可以证明，合理使用外源激素能影响嫁接亲和力，从而提高接口愈合速度和枝条生长量。外源激素在油茶大树嫁接方面的应用较少，在生长过程中植株的生理生化变化以及作用机理还有待进一步研究。