犬瘟热病毒时间分辨免疫荧光分析方法的建立及初步应用

陈翠翠，赖宏锐，梁焕坤，钟树海，黎杰星，李来庆

（广州优迪生物科技股份有限公司，广东 广州 510663）

犬瘟热（Canine distemper，CD）是肉食动物的一种急性、高度接触性、热性传染病[1]，由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）感染引起，其死亡率可高达90%[2]，雪貂高达100%[3]，在家养犬CDV 病死率约为50%。CDV 自然感染宿主除食肉目8 个科外， 还扩展到猪、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，其危害性也越来越大[4-5]。因此早期、快速、准确的诊断犬瘟热病，对养犬业和野生动物保护业具有重要意义。目前，检测CDV 的方法常见有病毒分离、免疫荧光抗体技术、免疫组化、RT-PCR 方法等，但均存在繁琐、重复性差等不足，而且在基层难以推广应用。

时间分辨免疫荧光分析法（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）是一种超微量免疫分析定量检测技术，具有灵敏度高、检测范围宽、操作简便等特点[6]。该方法用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物[7-9]，标记蛋白质、抗体、核酸探针等，利用TRFIA 检测仪测定反应产物中的荧光强度，可以快速、精准的定量检测病原感染情况。目前，尚未有CDV TRFIA 的报道。本研究使用一株抗CDV 的单克隆抗体（MAb）作为包被抗体，Eu3+标记的另一株MAb 作为检测抗体，建立了CDV 的双抗体夹心TRFIA，为检测CDV 提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 抗CDV单克隆抗体（MAb）3H7（包被抗体，效价1∶160 000）、2G4（检测抗体，效价1∶320 000）和CDV 标准抗原（由犬瘟热病毒的H 蛋白和F 蛋白列通过一段柔性连接肽（GGGGS）n 连接并进行真核表达的重组蛋白，G 表示为甘氨酸，S 表示为，丝氨酸，n≥1。经Meridian Life Science 公司，#2A02219 CDV 病毒标定，相当于1.46×103TCID50/mL）均由广州优迪生物科技股份有限公司制备；铕（Eu3+）标记试剂盒购自PerkinElmer 公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Fitzgerald 公司；Sephades-G50 填料购自GE 公司；96 孔板购自Costar 公司；包被缓冲液、洗涤液、封闭液、增强液均为自制。Victor 1420 全自动时间分辨荧光免疫分析检测仪购自PerkinElmer 公司。65 份疑似CDV 患病犬的眼鼻分泌物，15 份CDV 阴性样品均由广州富懋动物医院提供。

CDV、犬细小病毒（Canine parvovirus virus，CPV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus, CPIV）、犬腺病毒1 型（Canine adenovirus type 1，CAV-1）、犬冠状病毒（Canine coronavirus，CCV）均购由广州优迪生物科技股份有限公司制备保存。

1.2 固相包被抗体的制备 将包被抗体3H7 采用50 mmol/L、pH9.6 的碳酸盐缓冲液稀释为5 μg/mL，10 μg/mL 和15 μg/mL，利用方阵法进行包被浓度的优化。包被抗体加入96 孔微孔板中包被，4 ℃过夜，弃包被液，加入封闭液（5% BSA 的PBS 溶液，pH 7.4），每孔250 μL，37 ℃封闭2 h，弃掉封闭液，洗涤液（0.5%Tween-20 的PBS 溶液，pH 7.4）洗涤2 次，真空冷冻抽干，于-20℃保存备用。

1.3 Eu3+标记检测抗体及其纯化 将0.5 mg 检测抗体2G4 加入到带有滤膜的离心管中，以8 000 r/min离心8 min。设置Eu3+标记试剂：标记抗体比例分别 为70 μL∶30 μL，60 μL∶40 μL，50 μL∶50 μL，40 μL∶60 μL 和30 μL∶70 μL，利用铕（Eu3+）标记试剂盒采用方阵法进行优化标记比例，并根据Eu3+标记试剂盒说明书所提供的公式计算标记率。

1.4 标准品的制备 用含0.2% BSA、0.1% NaN3、50 mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液（pH 7.8），将CDV 抗原配制成浓度为0、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL、640 ng/mL 的系列标准品溶液，每瓶1 mL 分装冻干，-20 ℃保存备用。使用时分别加入1 mL分析缓冲液（8 mmol/L NaCl，0.1%明 胶，0.1% NaN3，0.1 mL/L Tween-80 的Tris-HCl 溶液，pH 7.8）溶解使用。

1.5 TRFIA 方法检测性能评估

1.5.1 绘制标准曲线 使用CDV系列标准品（0、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL、160 ng/mL、640 ng/mL）绘制标准曲线，每个浓度测定3 个复孔，共测定3 次，用双对数数学模型（Log-Logit）进行标准曲线的拟合。以无CDV 标准品为样本，将其测定的20 次荧光值均值加上2 倍的标准差（mean+2SD）代入标准曲线方程，计算TRFIA 方法的灵敏度。

1.5.2 准确度实验 对浓度已知的3 个CDV 标准品（17.6 ng/mL、21.0 ng/mL 和34.8 ng/mL）分别按1∶2、1∶4、1∶8 倍比稀释，每个样本重复检测3 次，比较样本的测定值、真值并计算其稀释回收率（测定值/真值×100），用稀释回收率分析该检测方法的准确度。

1.5.3 特异性实验 利用本研究建立的TRFIA 方法同 时 检 测CDV 标 准 品、 CPV、 CPIV、 CAV-1、CCV，进行特异性实验。

1.5.4 精密度实验 将CDV 标准品稀释至高（500 ng/mL）、中（100 ng/mL）、低（10 ng/mL）3 个浓度，各设3 个复孔重复检测10 次，计算高、中、低3 个浓度标准品测定的均数、标准差及变异系数（CV），评价该试剂盒精密度。

1.5.5 稳定性实验 用本研究制备的TRFIA 试剂盒置于4 ℃6 个月和37 ℃7 d，对试剂盒的物理外观，剂量-反应曲线的线性、灵敏度、准确度、特异性等指标进行测定，具体检测方法同上。

1.6 临床样本的检测 采用本研究建立的TRFIA 方法与RT-PCR[10]同时检测65 只具CD 临床症状并经CDV 胶体金试纸条诊断为阳性的疑似感染犬和15 只健康犬的眼鼻分泌物，对检测结果进行对比分析，以评估本TRFIA 法的临床检测效果。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件。结果以mean±SD 表示，GraphPad Prism 5 软件计算标准曲线方程， Origin8 软件进行绘图。

2 结 果

2.1 TRFIA 最佳反应条件的确定 本研究建立的双抗体夹心TRFIA 分析法，经过对包被浓度、Eu3+标记试剂：标记抗体比例、反应体系的体积、增强液配方等条件的优化，最终确定了最佳的TRFIA 反应条件如下：包被抗体的浓度为10 μg/mL，100 μL/孔；Eu3+标记试剂：标记抗体最佳比例70 μL∶30 μL（标记物的标记率为每个检测抗体上平均标记9.41 个Eu3+）；反应体系为25 μL 标准品或待测样品+200 μL分 析缓冲液+200 μL/孔Eu3+-检测抗体+200 μL/孔增 强 液；增 强 液 配 方：20 μmol β-NTA，50 μmol TOPO，0.1% Triton X-100，0.1 mol/L 邻苯二甲酸氢钾，0.5% 冰醋酸，pH 3.2。具体检测步骤参照文献进行[11]。

2.2 标准曲线及其灵敏度结果 以CDV 标准品系列浓度为横坐标，其对应的荧光值为纵坐标，绘制的标准曲线如图1 所示，方程为：y=2.36+1.025x，线性范围为2.5 ng/mL～640 ng/mL，R2=0.9998，表明本检测方法具有良好的剂量-反应效应。平行测定10 次无CDV 参考标准品的荧光值，并计算其均值（Mean）及标准差（SD），用mean+2SD 代入标准曲线方程，计算得出TRFIA 法的检测下限为0.58 ng/mL。

图1 CDV TRFIA 试剂盒的标准曲线及变异系数Fig.1 Standard curve and coefficient of variation of CDV TRFIA Kit

2.3 准确度实验结果 准确度实验结果如表1 所示，3 个样品3 个水平稀释度的稀释回收率在98.98%～105.91%，稀释倍数与浓度呈线性关系，表明本研究建立的TRFIA 法准确度较高。

表1 CDV TRFIA 试剂盒的稀释回收率测定(%)Table 1 Determination of dilution recoveries of CDV TRFIA Kit

2.4 特异性实验结果 利用本研究建立的TRFIA 法检测宠物临床常见病毒，结果显示，除CDV 为阳性外， CPV、CPIV、CAV-1、CCV 均为阴性，无明显交叉反应（表2）。表明该试剂盒特异性良好。

表2 CDV TRFIA 试剂盒的特异性实验结果Table 2 Determination results of the specificity of CDV TRFIA Kitt

2.5 精密度实验结果 用本研究制备的TRFIA 试剂盒进行精密度实验，结果显示：批内CV 值5.60%～7.58%，批间CV 值5.67%～7.64%，批内批间CV 值均小于10%（表3），符合临床检测试剂盒要求。表明该TRFIA 方法制备的试剂盒精密度较高。

表3 CDV TRFIA 试剂盒的精密度测定结果Table 3 Determination results of the CV of CDV TRFIA Kit

2.6 稳定性实验结果 对本研究制备的TRFIA 试剂盒稳定性测试结果显示，参考标准品的各点荧光值并未随着条件的改变而发生明显变化，试剂盒检测性能无明显改变，符合试剂盒稳定性要求。试剂盒置于4 ℃能稳定保存6 个月以上，37 ℃热破坏性试验能稳定保存7 d 以上。表明该TRFIA 方法制备的试剂盒稳定性好。

2.7 临床样本的检测结果 利用本研究建立的CDV TRFIA 检测试剂盒与RT-PCR 法同时检测临床眼鼻分泌物样品，结果显示，疑似样本63 份阳性，2 份阴性；15 只健康犬均为阴性， 两种检测方法的符合率为100%。表明本研究建立的CDV TRFIA 方法可快速、准确、定量检测CDV 临床样本。

3 讨 论

犬瘟热是由CDV 引起的一种具有高度传染性和致命的全身性疾病，不仅感染犬和其它食肉动物，也在一些非食肉动物发现[12-13]。近几年，宠物犬业发展迅速，CDV 危害严重，造成严重的经济损失。因此，CDV 快速检测技术在该病综合防治中至关重要。

目前，检测CDV 的方法较多。病原学方法主要是实验室对病毒的分离、培养及其鉴定，所需时间长，特异性差。近年来随着科研用仪器设备的不断更新，PCR 和核酸杂交大大提高了CDV 检测的准确性和特异性，缩短了检测时间，但其需要专业的仪器和人员，限制了其广泛应用[14]。在此背景下，胶体金检测试纸因其方便、快捷和成本低廉的优势，在CDV 初级筛查（定性分析）中得到广泛应用[15]。但是对于CDV 的定量分析，目前尚缺乏简便快捷的检测方法。TRFIA 法可实现完全定量分析，具有敏感性强、特异性好、便捷等优势，成为目前最有发展潜力的检测方法。

本研究所研制的试剂盒测定结果显示，试剂盒的灵敏度达到0.58 ng/mL，检测样本浓度在2.5 ng/mL～640 ng/mL 范围内线性良好，检测范围宽，实现了CDV 定量分析，优于病原学和胶体金法仅定性分析的局限性[14-15]。本试剂盒研制参照人体临床检测试剂研制的相关要求（必须设置高中低3 个浓度），并从临床样本实际情况考虑（犬感染瘟热病毒轻重程度不一，造成血液中病毒含量有高有低），设置了高中低3 个浓度，进行精密度实验，其批内与批间的CV 小于10%，达到临床测试要求（批内CV＜10%，批间CV＜15%）；此外，临床样本对比试验表明，本TRFIA法与传统的PCR法相比，检测结果的符合率达到了100%，操作简单快捷，可以替代PCR 法用于CDV 的快速定量分析[6,16]。

综合比较CDV 的病原学分析、胶体金法和PCR法检测的优缺点，本研究研制的TRFIA 法能快速、定量、准确诊断CDV 感染，具有强特异、高敏感、方便快捷等优点，适用于大批量临床样品检测，具有极大的应用前景。