2018 年～2019 年河北地区蛋鸡源大肠杆菌流行病学调查与分析

张召兴，李佩国，陈 玥，李蕴玉，张香斋，贾青辉，张建文

（1. 河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066004；2. 河北旅游职业学院 畜牧兽医系，河北 承德 067000）

鸡大肠杆菌病是鸡养殖中的常见病和高发病之一，在临床中呈现病型多样，其中以急性败血症型为常见，具有发病快，死亡率的特点[1-2]。发病鸡和带菌鸡是鸡大肠杆菌病的主要传染源，该病不仅可以通过经呼吸道、消化道传播，还可以经卵传播，可以感染不同日龄的鸡，以雏鸡和青年鸡易感性较高，且季节性不明显，常与其它疾病混合感染，给养鸡业造成很大的危害[3-4]。鸡大肠杆菌拥有复杂的抗原结构和多样性血清型，主要包括O 抗原、表面K 抗原及鞭毛H 抗原3种菌体抗原，其中O 抗原是临床中大肠杆菌主要血清型鉴定的抗原[5]。相关研究表明大肠杆菌O 抗原血清型共有196 种，我国报道中鸡大肠杆菌的主要流行的血清型有O1、O2、O5、O7、O78、O103等，鸡大肠杆菌血清型众多，且不同血清型之间的菌株缺乏交叉免疫，不同地区流行的优势血清型不同，无法通过疫苗的免疫获得保护性，给疫苗的研制带来一定的困难[6-7]。抗菌药物是当前防治该病的重要手段之一，由于长期、不合理的应用，致使大肠杆菌耐药性日益严重，耐药机理改变，呈现多重耐药和交叉耐药。另外，大肠杆菌在宿主体内被杀死后所释放的内毒素可引起多种疾病，同时也造成药物残留威胁人们的健康，成为公共卫生问题[8]。

2018 年～2019 年，本研究团队采集秦皇岛、唐山、承德、邢台等地区不同养殖场病死蛋鸡的肝脏、心血、脾脏等病料组织173 份，从中分离得到120 株大肠杆菌，对其进行血清型、耐药性及耐药基因研究，并分析其流行病学特点，为河北地区蛋鸡大肠杆菌防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及主要试剂 肝脏、心血、脾脏等病料组织173 份，采集自2018 年～2019 年秦皇岛、唐山、承德、邢台等地区不同养殖场病死蛋鸡，E.coli 质控菌株ATCC25922 由河北省预防兽医学重点实验室保存。

麦康凯培养基、大肠杆菌显色培养基、普通营养肉汤均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；24 种抗菌药物购自上海宸功生物技术有限公司；ExTaq DNA 聚合酶均购自TaKaRa 公司；DL2000 Marker 购自北京中科瑞泰生物科技公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；E.coli 标准O 型血清因子、0.5%石炭酸生理盐水均购于中国兽医药品监察所。

1.2 细菌分离纯化与鉴定 采集的病死鸡的肝脏、心血、脾脏等病料组织按常规方法处理后，接种于麦康凯培养基37 ℃恒温划线培养12 h～18 h，挑取单个菌落接种于大肠杆菌显色培养基，37 ℃、12 h～18 h 进行鉴定培养，同时进行革兰氏染色镜检与生化鉴定。

1.3 细菌16S rRNA PCR 鉴定 利用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取分离菌株基因组DNA，参照文献[5]合成大肠杆菌16S rRNA 基因保守区引物，采用PCR 方法进行分离菌株鉴定，引物合成及PCR 产物测序均在上海生工生物工程有限公司进行。测序结果采用NCBI-BLAST 比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。

1.4 细菌O 型血清型鉴定 参考文献[7]，采用E.coli 标准O 型血清因子，采用玻片凝集试验检测分离菌株的O 型血清型，以0.5%石炭酸生理盐水作为对照。

1.5 细菌的耐药性检测 采用K-B 药敏纸片法对分离菌株进行药敏试验，以大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株，参照美国临床检验标准委员会（NCCLS）推荐的药敏试验操作方法和标准进行试验结果判断[9]，对分离菌株的试验结果进行统计，分析其耐药性。

1.6 细菌耐药基因的PCR检测 参考文献[10-11]，由上海生工生物工程有限公司合成43种大肠杆菌耐药基因引物，包括：β-内酰胺类（blaTEM、blaSHV、OXA-1、ACT-1、blaCTX-5），氨基糖苷类（aadA1、aadA2、StrA、StrB、aaC2、aaC4、aadB、aadD、npmA、ant-Ia、aac（3）-Ia、aac（6）- Ib），四环素类（tetA、tetB、 tetC、 tetD、 tetE、 tetG、 tetM）， 酰 胺 醇 类（floR），大环内酯类（ermA、ermB、mefA），磺胺类（dhps、Sul-1、Sul-3），喹诺酮类（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA、oqxB、gyrA、gyrB、gyrC、gyrE）。利用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取分离菌株基因组DNA，以提取的基因组DNA 为模板，采用PCR 方法进行检测，将PCR 产物送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果采用NCBIBLAST 比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。

1.7 细菌的耐药表型与耐药基因相关性分析 参考文献，采用统计学软件SPSS19.0 分析河北地区分离的120 株大肠杆菌耐药表型及耐药基因型之间相关性，计算其符合率。

2 结 果

2.1 细菌的分离鉴定结果 通过麦康凯培养基、大肠杆菌显色培养基及营养肉汤对分离菌菌株进行分离与纯化及染色镜检、生化鉴定、16S rRNA 鉴定。结果显示，从采集的173 份病料组织中分离到了120 株大肠杆菌，分离率为69.4%，其中秦皇岛分离45 株、唐山21 株、形台28 株、承德26 株。表明大肠杆菌在河北地区蛋鸡养殖中广泛流行。

2.2 细菌O 型血清型鉴定结果 采用E.coli 标准O型血清因子，利用玻板凝集试验检测分离菌株的O型血清型。结果显示，分离的120 株大肠杆菌分离菌株分属于6 种血清型，其中O78 型90 株，占分离菌株的74.2%；O2 型14 株，占分离菌株的11.7%；O89 型11 株，占分离菌株的9.2%；O1 型3 株，占分离菌株的2.5%；O18 型2 株，占分离菌株的1.7%；O38 型1 株，占分离菌株的0.8%。表明该地区分离的120 株大肠杆菌以O78 型、O2 型和O89 型为主要的流行血清型。

2.3 细菌耐药性分析结果 采用K-B 药敏法对河北地区分离的120 株大肠杆菌进行了药敏试验，分析其耐药性及多重耐药性。结果显示：分离的120株大肠杆菌对复方新诺明、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、头孢拉啶、林可霉素、新霉素、土霉素、青霉素8 种药物耐药较高，耐药率75.8%～98.3%；对多西环素、卡那霉素、氨苄西林、头孢曲松、恩诺沙星、环丙沙星6 种药物耐药率45.8%～71.7%；对其它药物的耐药率15.0%～43.3%（表1）。

表1 大肠杆菌分离株耐药性检测结果Table 1 Antibiotic resistance rate of all isolated E.coli

按区域对耐药性进行分析，结果显示秦皇岛、唐山、邢台、承德4 个地区分离的大肠杆菌对青霉素、阿莫西林、 林可霉素、磺胺间甲氧嘧啶、复方新诺明、磺胺二甲氧嘧啶6 种药物耐药性严重，其中秦皇岛分离的大肠杆菌对头孢曲松、头孢拉定、多西环素、氟苯尼考、新霉素5 种药物耐药严重，唐山分离的大肠杆菌对头孢拉定、庆大霉素、大观霉素、新霉素、土霉素、多西环素、替米考星7 种药物耐药严重，邢台分离的大肠杆菌对氨苄西林、头孢拉定、卡那霉素、庆大霉素、大观霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星9 种药物耐药性严重，承德分离的大肠杆菌对氨苄西林、头孢拉定、卡那霉素、多西环素、恩诺沙星、环丙沙星6 种药物耐药严重（表2）。表明河北地区分离的120株大肠杆菌耐药性比较严重，秦皇岛、唐山、邢台、承德4 个地区的耐药性呈现多样性。

多重耐药性分析结果显示，由分离的120 株大肠杆菌分离菌株中，耐3、4、7 种药物的菌株各1株（0.83%），耐6种药物的菌株3株（2.50%），耐8种药物菌株4株（3.33%），耐9、10、12、14药物的菌株各7株（5.83%），耐11 种药物的菌株13 株（10.83%），耐13、15 种药物的菌株各9 株（7.50%），耐16、17 种药物的菌株各11 株（9.17%），耐18 种药物的菌株8 株（6.67%），耐19、20、21、22 种药物的菌株各5 株（4.17%），其中1 株菌最高耐23 种药物。表明河北地区分离的120 株大肠杆菌对临床中常用的24 种抗生素呈现多重耐药现象。

表2 不同地区对各抗生素耐药的大肠杆菌菌株数Table 2 Number of resistant E.coli isolates from different areas

2.4 细菌耐药基因检测结果 采用PCR 方法对河北地区分离的120 株大肠杆菌分离进行43 种耐药基因检测。结果显示，分离菌株携带29 种耐药基因，检测出率为67.4%（29/43）， 耐药基因ant-Ia、tetC、tetB、tetA、aadA1、blaTEM、OXA-1、tetM 检测出率最高，检出率84.2%～99.0%；耐药基因gyrB、floR、gyrC、gyrE、blaCTX-5 的检出率78.3%～66.7%；耐药基 因gyrA、 dhps、 aaC2、 StrA 的 检 出 率55.8%～42.0%；耐药基因aadB、aaC4、oqxB、aadA2、sul-3、aac（6）-Ib、oqxA、ermB、strB、sul-1、tetD、aac（3）-Ia12 的检出率38.3%～19.2%；其余14 种耐药基因未检出。表明河北地区分离的120 株大肠杆菌携带多种耐药基因。

多重耐药基因型分析结果显示，分离的120 株大肠杆菌分离菌株中，携带10 种耐药基因的菌株1株（0.83%），携带11、12、20、22 种耐药基因的菌株各3 株（2.50%），携带13 种耐药基因的菌株11 株（9.2%），携带14、15 种耐药基因的菌株各12 株（10.0%），携带16 种耐药基因的菌株19 株（15.8%），携带17 种耐药基因的菌株18 株（15.0%）；携带18 种耐药基因的菌株22 株（18.3%），携带19 种耐药基因的菌株7 株（5.8%），携带21 种耐药基因的菌株6 株（5.0%）（图1）。表明河北地区分离的120 株大肠杆菌携带多重耐药基因，呈现多重耐药基因型。

2.5 细菌的耐药表型和耐药基因型相关性分析结果 经过统计学软件分析河北地区分离的120 株大肠杆菌耐药表型及耐药基因型之间相关性。结果显示，β-内酰胺酶类、酰胺醇类四环素类3 类抗菌药物的耐药表型和耐药基因型符合率均为100%，磺胺类、喹诺酮类大环内酯类、氨基糖苷类的耐药表型和耐药基因型符合率72.7%～93.8%（表3）。表明河北地区分离的120 株大肠杆菌耐药表型及耐药基因型之间基本呈正相关。

图1 大肠杆菌分离菌株多重耐药基因型检测结果Fig.1 Detection of multi-drug resistance genotypes of E.coli isolates

表3 大肠杆菌分离菌株耐药表型和耐药基因型相关性分析结果Table 3 Relevance analysis of drug resistance phenotype and genotype of E.coli isolates

3 讨 论

目前，鸡大肠杆菌可以通过垂直传播，种鸡有可能成为该病主要传染源之一，在蛋鸡养殖业中需加强防治。本实验从河北地区病死蛋鸡病料组织中分离鉴定出120 株大肠杆菌，其中以O78 型、O2 型和O89 型为该地区主要流行的优势血清型，可以做为研制鸡大肠杆菌多价疫苗的候选株。贾雪波等报道2016 年上半年分离自安徽和山东部分地区的80株APEC 以12.5%菌株（10 株）O1 血清型，15.0%菌株（12 株）为O2 血清型，25.0%菌株（20 株）为O78 血清型，47.5%菌株（38 株）为其它未定血清型[12]。徐政平报道江苏、山东、浙江、上海、安徽等5省市不同地区的分离得到120 株鸡源大肠杆菌流行的优势血清型为O78 和O88[4]。刁有江等报道山东部分地区的45家养禽场分离到致病性大肠杆菌96 株中以O78、O2、O15、O18、O143、O88 等6 种优势血清型[13]。本研究结果与上述报道的存在一定差异性，说明地区间大肠杆菌血清型呈现多样性分布流行。结合本课题组2017 年从河北秦皇岛地区不同养殖场的中分离到46 株蛋鸡源致病性大肠杆菌，研究发现以O78、O89、O142 及O1 为优势血清型[5]，可以得出近几年蛋鸡源O89 型大肠杆菌作为优势血清型在在河北地区流行，国内在别的地区报道较少，应该引起重视。临床中鸡大肠杆菌常与支原体等病原混合感染，是蛋鸡养殖生产常见传染病，造成相关疾病的免疫失败，进而导致新城疫、禽流感等病毒性疾病的爆发[2-4]。因此，防治鸡大肠杆菌病是降低鸡其它传染病发病率的重要基础。

鸡大肠杆菌耐药性产生与平时饲养管理具有密切的关系，在养殖过程中，长期不合理的使用抗菌要药物，小剂量使用等，均导致大肠杆菌的很强的耐药性[14]。相关研究表明养殖业中常用的阿莫西林、氨苄青霉素、复方新诺明、链霉素、四环素等抗生素，出现普遍的耐药性，其耐药率甚至达到了100%，并且出现了大量多重耐药菌株，甚至可能演化出“超级细菌”，另外还可以通过粪便传播耐药性大肠杆菌[15]。由于抗菌药物的不合理的使用，鸡大肠杆菌产生超广谱-内酰胺酶（ESBLs），携带ESBLs的质粒，不仅耐β-内酰胺类抗生素的菌株同时也对氟喹诺酮类、氨基糖苷类有一定的多重耐药性，使产ESBLs 菌具有多重耐药表型[16]。大肠杆菌耐性的产生与饲养管理有很大相关性，其耐药性遗传学的“诱发突变”是由药物导致的可遗传的变化，由于外界的条件改变可导致耐性的“适应性变异”[17]。同时耐药性质粒可以在不同菌株之间通过一定的方式在传播，进而导致多重耐药性菌株产生[18]。本实验分离的120 株大肠杆菌耐药性严重，且呈现多重耐药性。与本实验室贾青辉等报道的2013 年～2016 年河北地区分离鉴定的104 株蛋鸡源大肠杆菌的耐药性及多重耐药表型相比，具有一定的升高趋势[19]。可能由于大肠杆菌长期接触某种抗菌药物可以产生的选择性压力，进而导致其耐药性的产生。经统计秦皇岛、唐山、邢台、承德4 个地区分离的大肠杆菌对24 种抗菌药物呈现多样性耐药性，针对该病防治应该根据药敏试验，合理使用抗菌药物，减少耐药性产生，提高治疗，对临床中蛋鸡大肠杆菌病防治具有重要指导意义。蛋鸡养殖场中可以通过控制环境、消毒等预防大肠杆菌病的发生与流行，使用益生菌、中药等制剂防治大肠杆菌病，减少或者替代抗菌药物的使用。

大肠杆菌基因组中编码的耐药基因主要位于质粒和转座子等可移动基因元件上，在外界抗菌药物对细菌产生选择压力时，可以改变大肠杆菌的耐药机制，进而细菌对抗菌药物耐产生很强的药性，且可以在不同菌株中扩散与传播，大肠杆菌携带耐药基因型的表达在耐药性中起着重要的作用[19-20]。许多研究表明，耐药基因与耐药具有一定相关性。本实验通过检测分析表明，耐药表型与耐药基因型携带基本呈正相关。与于静晨等[10]报道的从江苏、安徽等地分离的53 株禽致病性大肠杆菌耐药基因与耐药菌株检出率基本呈正相关一致。耐药表型与携带的耐药基因型符合率不一致，有可能还存在其它耐药基因，或者有其它耐药机制产生的耐药性。因此，大肠杆菌耐药基因型的表达致使耐药性的产生及在不同菌株传播机理尚未明确，有待进一步研究。本研究结果提示在蛋鸡养殖过程中应该注意抗菌药物合理使用，同时本研究为河北地区蛋鸡大肠杆菌的防控提供了参考。