狐源金黄色葡萄球菌的分离鉴定

刘勃兴 赵安奇 康圆圆 滕文萍 吴同垒 史秋梅 张志强

狐源金黄色葡萄球菌的分离鉴定

刘勃兴 赵安奇 康圆圆 滕文萍 吴同垒 史秋梅 张志强

（河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室 河北 秦皇岛 066004）

为确定引起秦皇岛某狐养殖场的银狐死亡病因，从病死银狐肝脏、肺脏等分离到一株细菌，采用革兰氏染色、细菌的生化鉴定、16S rDNA鉴定、致病性试验以及药物敏感性试验对分离菌进行研究。试验结果显示，分离菌为金黄色葡萄球菌；该菌可致小鼠死亡，死亡率100%；分离菌对头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星共3种抗生素表现敏感，对阿莫西林、新霉素等共8种抗生素表现耐药。本研究分离狐源金黄色葡萄球菌具有较强的致病性和耐药性，为金黄色葡萄球菌感染狐所致疾病的诊治提供参考。

狐 金黄色葡萄球菌 分离鉴定 耐药性

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)属于革兰氏阳性菌中的葡萄球菌属(Staphy-lococcus)中的一员，在自然界中广泛存在，是一种常见的人畜共患病原[1]。SA可引起奶牛乳房炎，犬、兔的脓皮症，多种动物的败血症，是制约我国养殖业健康发展的重要细菌病原，对人与动物公共卫生安全造成威胁[2]。目前，金黄色葡萄球菌感染病例通常采用抗生素类药物治疗，但由于耐药菌株的出现，导致在临床上多种抗生素药物治疗效果不佳，因此，致病性金黄色葡萄菌的耐药性的检测具有十分重要的现实意义。本研究从一例患有败血症的银狐体内分离到一株疑似金黄色葡萄球菌的菌株，对其进行鉴定并对分离菌株的致病性和耐药性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 病死银狐由秦皇岛某狐养殖场送样，临床剖检症状以败血症为主。

1.1.2 试验动物 昆明小鼠，体重(20±2)g，购自北京维通利华试验动物有限公司。

1.1.3 主要试剂 胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，购自岛高科技工业园海博生物技术有限公司；哥伦比亚血琼脂培养基(羊血)，购自广州迪景微生物科技有限公司；革兰氏染色液，购自北京博奥拓达科技有限公司；药敏纸片，链球菌细菌生化编码鉴定管,均购自杭州滨和微生物科技股份有限公司；2×Taq Master Mix、细菌DNA基因组提取试剂盒，均购自康为世纪生物科技有限公司；PCR扩增引物合成和序列测定服务均由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化 无菌采取病死狐肝脏，在超净台中将肝脏接种于血琼脂培养基中，在37℃恒温培养箱中培养24h，挑取优势菌落接种于TSB培养基中，置于37℃恒温摇床培养12h。

1.2.2 分离菌的革兰氏染色 按照革兰氏染色液说明书对分离菌进行染色，染色后用显微镜的油镜观察。

1.2.3 分离菌的生化鉴定 按照生化鉴定管的说明书操作并对结果判定。

1.2.4 分离菌的16S rDNA鉴定 由上海生工生物工程公司合成16S rDNA通用引物，引物序列为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌DNA作为PCR模板。PCR反应体系(总体积50μl)上游引物、下游引物、模板均为1μl，2×Taq Master Mix 25μl，ddH2O 22μl。PCR反应程序94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸10min。反应结束后将PCR产物切胶回收，将回收产物送至上海生工生物工程公司测序。测序结果在NCBI的Blast分区检索并下载相关参考菌株序列，用Lasergene软件的Megalign功能建立进化树和同源性比对。

1.2.5 分离菌的致病性试验 参考文献[3, 4]中的方法，以昆明小鼠为动物模型进行致病性试验。将纯化后的菌液转接至TSB培养基，置于恒温摇床培养12h，离心弃上清，用无菌PBS缓冲液重悬，调整菌液浓度至1×108cfu/ml。感染组小鼠5只，每只小鼠腹腔注射0.1ml调整浓度后的菌液；对照组小鼠5只，每只小鼠腹腔注射0.1ml无菌的PBS缓冲液。连续观察试验小鼠一周，记录发病及死亡情况，剖检死亡小鼠，分离肝脏、心脏等器官细菌并鉴定。

1.2.6 分离菌的药物敏感性试验 采取KB纸片法检测分离菌对15种抗生素的敏感性，试验操作以及结果判定按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准进行。

2 结果

2.1 分离菌的培养特性和形态特征

分离菌在血琼脂培养基上培养，菌落表面光滑，湿润，隆起，呈淡黄色的卵圆形，菌落周围有明显的β溶血环。革兰氏染色结果显示，分离菌为革兰氏阳性球菌，大部分呈葡萄状排列。

图1 分离菌的培养特性和形态特征

A分离菌在血琼脂培养基菌落形态；B分离菌的革兰氏染色形态(100×)

2.2 分离菌的生化鉴定

生化鉴定试验结果显示，分离菌能分解蔗糖、甘糖、麦芽糖、甘露醇、尿素，还原硝酸盐，其余反应均为阴性(表1)。将试验结果对照《伯杰氏细菌鉴定手册》，符合金黄色葡萄球菌的生化特性。

表1 分离菌的生化鉴定结果

2.3 分离菌的16S rDNA鉴定

分离菌的系统发育进化树和同源性比对见图。系统发育进化树显示，分离菌与金黄色葡萄球菌参考菌株处于同一分支，与链球菌属参考菌株处于同一个大分支，与大肠杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌属的参考菌株不在同一分支。同源性比对结果显示，分离菌与金黄色葡萄球菌参考菌株同源性为100%。分离菌的16S rDNA鉴定结果表明，分离菌为金黄色葡萄球菌。

图2 分离菌的16S rDNA鉴定结果

C系统发育进化树；D同源性比对

2.4 分离菌的致病性试验

分离菌感染小鼠后，小鼠精神萎靡，共济失调，并于36h全部死亡。剖检死亡的小鼠，发现其肺脏、肝脏等器官有明显出血症状，分离肝脏、心脏细菌并鉴定，分离到金黄色葡萄球菌。对照组小鼠无病征以及死亡。

2.5 分离菌的药物敏感性试验

分离菌药物敏感性结果见表2。分离菌对头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星共3种抗生素表现敏感，对氨苄西林、阿米卡星、卡那霉素、替米考星共4种抗生素表现中介，对阿莫西林、新霉素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、复方新诺明共8种抗生素表现耐药。分离菌具有多重耐药性，并且耐药情况比较严重。

表2 分离菌的药物敏感性试验结果 (mm)

注：R表示耐药，I表示中介，S表示敏感。

3 讨论

（1）金黄色葡萄球菌是人畜共患的条件性致病菌，在空气、水、土壤等环境和动物机体内广泛存在[5]。有报道从患病的牛、兔、鸡等动物分离到金黄色葡萄球菌的报道[6-8]，但国内外从患病毛皮动物分离到金黄色葡萄球菌的报道较少，因此，临床诊断过程中对金黄色葡萄球菌感染所致毛皮动物发病未得到人们重视。本次从患有败血症的银狐肝脏分离到一株金黄色葡萄球菌，通过致病性试验发现该分离菌感染小鼠后小鼠死亡率较高，说明分离菌具有较强致病力。商圆圆从患病水貂体内分离到金黄色葡萄球菌，其分离菌同样具有较高的致病性[9]。因此，在临床诊断过程中应注意金黄色葡萄球菌感染毛皮动物发病。（2）由金黄色葡萄球菌引起的动物疾病的防治主要依赖于抗生素类药物，但由于抗生素类药物滥用，导致细菌的耐药性愈加严重，最终使抗生素类药物的治疗效果越来越差。本次分离的狐源金黄色葡萄球菌具有严重的耐药性，仅β－内酰胺类的头孢曲松，喹诺酮类环丙沙星和恩诺沙星对该菌具有较好的抑菌效果，其余抗生素类药物的对分离菌的抑菌效果不佳甚至无抑菌效果。但由于不同地区饲养方式和治疗方法不同，因此，建议临床治疗狐感染金黄色葡萄球菌所致疾病先通过药物敏感性试验筛选出抑菌效果较好的药物，再根据临床情况合理用药，可以减少细菌耐药性的产生，还可减少养殖户的经济损失。（3）若经诊断养殖的动物感染金黄色葡萄球菌，应及时就诊，并注意加强饲养管理，提高机体免疫力，对饲养环境、水槽食槽等进行消毒，避免疾病扩散传播。

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秦皇岛市科技创新平台建设运行项目(201702B001)；河北省科技厅项目(18246629G)；河北省教育厅项目(ZD2017234)；农业部特种动物疫病重点试验室开放课题(01830)

（2020–02–29）

S852.61+1

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1007-1733(2020)06-0004-03