肉鸡养殖中奇异变形杆菌的分离鉴定及其16S rRNA基因序列分析

袁东芳

肉鸡养殖中奇异变形杆菌的分离鉴定及其16S rRNA基因序列分析

袁东芳

（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）

为监测商品肉鸡养殖过程中奇异变形杆菌的携带情况，从山东7个不同地区的12个商品肉鸡场采集鸡泄殖腔棉拭子516份，根据菌落形态特征，革兰氏染色，传统的生化反应以及16SrRNA基因序列测序分析，分离鉴定出奇异变形杆菌61株，携带阳性率为11.82%。通过聚类分析、序列比对、构建系统进化树，从分子水平上证明分离菌株均为奇异变形杆菌，进一步表明不同地区的奇异变形杆菌存在亲缘性，但奇异变形杆菌的亲缘关系与地理分布关系不大。

肉鸡场 奇异变形杆菌 分离鉴定 16S rRNA

奇异变形杆菌(Proteus mirabillis，PM)属于肠杆菌科变形杆菌属，系无荚膜、无芽胞，有鞭毛、有菌毛的革兰阴性杆菌，为条件致病菌，当机体抵抗力较低时容易引起发病，多为继发感染，可引起泌尿系统感染、腹泻、菌血症和食物中毒等[1-2]。奇异变形杆菌作为一种人畜共患病，在自然界分布极广，人类、家畜及家禽的带菌率极高，应该引起足够重视[3]。近年来，我国山东、河南、河北、四川、广西等地不断有鸡群暴发奇异变形杆菌病，尤其是在季节更替、环境改变、转群和混合感染其他病原时，鸡群抵抗力下降，病情加重，病死率升高，给畜禽养殖业带来巨大的经济损失[4, 5]。

目前报道的奇异变形杆菌基本是从发病或病死的畜禽中分离的，为了监测商品肉鸡场在养殖过程中奇异变形杆菌的携带情况，有效防止奇异变形杆菌病的暴发，本文自2017年6月至2018年6月，从山东7个不同地区的12个商品肉鸡场采集鸡泄殖腔棉拭子516份，经细菌学鉴定及16Sr RNA基因序列测序分析[6]，分离鉴定出奇异变形杆菌61株，携带阳性率为11.82%。将不同地区分离菌株的16SrRNA基因序列以99%一致性[7]进行聚类分析，获得12条代表序列并进行分析。分析结果从分子水平证明分离菌株均为奇异变形杆菌。为养殖过程中奇异变形杆菌携带情况的监测，奇异变形杆菌病的临床诊断、鉴定和有效防制提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品 商品肉鸡泄殖腔拭子516份，来自于山东7个不同地区，分别是寒亭区123份、昌邑市137份、安丘市80份、莱西市62份、平度市105份、莱阳市82份、潍城区60份；

1.2 主要试剂 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、SS琼脂培养基、普通营养琼脂培养基(NA)、营养肉汤、革兰氏染色液均购自北京陆桥技术有限公司； A306细菌微量生化反应管购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；PCR试剂购自北京天根生化科技有限公司；引物由生工生物(上海)工程有限公司合成。

1.3 细菌的分离培养及纯化 将采集的泄殖腔拭子置于SC增菌液中，37℃，180r/m，培养24h，观察细菌的生长情况，SC增菌液呈红色浑浊状态，挑取菌液划线于SS平板，培养24h，观察菌落特征，挑取可疑菌落于NA平板上分区划线，纯化培养24h，挑取单菌落接种于营养肉汤中，37℃，180r/m，培养24h。

1.4 细菌的生化鉴定 挑取单个菌落接种于A306细菌微量生化反应管中，37℃，培养24h，观察记录结果。

1.5 16S rRNA基因扩增及序列测定 用试剂盒提取分离菌的DNA为模板，用细菌16srRNA的通用引物进行PCR扩增，PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序后，利用NCBI网站中Blast检索系统对测序得到的16srRNA基因序列进行同源性比对分析；对在Genbank中检索到的国内不同地域来源的奇异变形杆菌，通过Muscle比对，运用Fasttree构建系统发育树。

2 结果

2.1 细菌的分离及染色 分离菌株在SS平板上呈圆形隆起、边缘整齐、无色透明、橘黄色或中心黑色的中等大小菌落，在NA上呈扩散性生长，以接种点为中心形成波纹状同心环，布满整个平板。镜检可见分离菌为革兰氏阴性，呈杆状、球杆状、球状或短链状，表现多形性，主要以杆状为主。分离出的61株菌分别命名，寒亭区18株分别为H1-H18，昌邑区4株分别为C1-C4，安丘市9株分别为A1-A9，莱西市8株分别为L1-L8，平度市11株分别为P1-P11，莱阳市5株分别为Y1-Y5，潍城区2株分别为W1-W2。

2.2 生化试验结果 通过对照A306细菌微量生化反应管编码鉴定手册，分离菌的生化特性显示该61株分离菌均为奇异变形杆菌。

附表 分离菌的生化试验鉴定结果

生化试验结果判定生化试验结果判定生化试验结果判定 靛基质-枸橼酸盐+棉籽糖- VP-尿素酶+戊糖- 苯丙氨酸+硫化氢+山梨醇- 赖氨酸-磷酶-侧金盏花醇- 鸟氨酸+ONPG-二磷酶-