血小板衍生生长因子B链在pN0期非小细胞肺癌中的表达及与淋巴结微转移的关系

魏东 薛志芳 刘博 王耀一 郝雁冰

(河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000)

非小细胞肺癌(NSCLC)发病率占肺癌的85%左右，约75%的患者发现时已经是晚期，错失最佳治疗时机，据统计5年的生存率只有15%〔1〕。最近研究指出〔2〕，NSCLC患者治疗的预后及复发情况与淋巴结微转移灶的发生关系密切〔3〕，即使在Ⅰ期NSCLC行根治手术后仍会有约40%的患者出现复发和转移〔4〕，说明根治手术的区域淋巴结或远处组织中可能有着肿瘤的微转移病灶〔5,6〕。清楚准确的知道pN0期NSCLC患者是否有淋巴结的微转移灶形成是评判NSCLC患者预后的关键因素。随着人们对分子学的不断探索，发现淋巴结有无微转移灶与血小板衍生生长因子B链(PDGF-B)的表达之间存在某种联系。本研究旨在探讨PDGF-B在pN0期NSCLC中的表达及与淋巴结微转移关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 2017年7月至2018年7月就诊于河北北方学院附属第一医院50例肺癌(152枚淋巴结)根治术后经病理检查证实为pN0期〔7〕的NSCLC患者，及22例癌旁组织，石蜡包埋标本；年龄46～75岁，平均(52.3±11.2)岁。其中鳞癌32例，腺癌18例。按国际抗癌联盟(UICC2002)标准分期：ⅠA期18例、ⅠB期21例、ⅡB期11例。纳入标准：①患者病例资料齐全；②既往无相关化疗、手术等治疗史者；③所有非小细胞癌患者进行根治性肺叶切除术，患者手术方式为肺叶切除加系统淋巴结清扫术。④所有肺癌患者的重要功能脏器正常且可耐受手术。排除标准：①手术中发现肿瘤已经向肺内转移的患者；②淋巴纵隔疾病患者。本研究经医院伦理学会审查并通过，患者及家属知情且同意。

1.2研究材料 兔抗人 PDGF-B多克隆抗体(IgG型)；北京中杉金桥生物技术有限公司的SABC 试剂盒；细胞角质蛋白(CK)；美国 Hy-clone 公司的磷酸盐缓冲液(PBS)。

1.3研究方法 本研究手术后的标本用中性福尔马林液固定，并将其用石蜡包埋处理，随机选择常规病理检查阴性肺门淋巴结。制备连续的2个厚度为4 μm的石蜡切片，并进行免疫组化链霉菌蛋白生物素(LSAB)法脱蜡与水化；进行苏木素-伊红(HE)染色和小鼠抗人CK(广谱)抗体免疫组织化学(SP)染色。对实验标本按常规制作蜡块，石蜡切片每例3张，并以PDGF-B多克隆抗体进行SP染色。具体步骤如下：石蜡切片经脱蜡及水化，使用pH7.4的PBS冲洗3次，每次3 min。将所有切片放入pH=7.4的PBS溶液中，分别在微波炉的中及高档火中各烤5 min，并且对组织抗原进行修复。每张切片加滴1滴3% H2O2，24℃下孵育10 min，来使内源性过氧化物酶的活性丧失。PBS连续冲洗3次，每次3 min，去掉PBS。在切片上滴1滴第一抗体，24℃下孵育60 min。PBS冲洗3次每次3～5 min。去掉PBS溶液，每张切片滴加l滴MaxVsion溶液，24℃下孵育10～15 min。PBS冲洗3次，每次3 min。去掉PBS，滴加2滴二氨基联苯胺(DAB)液于切片上。二抗、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)反应各20 min(1∶100，20～37℃)；DAB镜下调控染色程度，流动水冲洗10 min；苏木素核复染；脱水、透明、封片、观察。每1步骤中间均用pH7.4、浓度为0.01 mol/L的PBS冲洗3～4次，每次3～5 min。

1.4观察指标 采用单盲法，病理科医师不清楚患者临床资料的情况下进行操作。评估患者PDGF-B的表达及淋巴结微转移情况。阳性细胞：细胞着色棕黄色颗粒或细胞线网状。按照切片中阳性细胞占比及细胞着色程度分成0～3分：0分=切片中阳性细胞数为零；1分=阳性细胞与总细胞数的占比<25%/5个高倍视野；2分=阳性细胞占总细胞数为25%～50%；3分=阳性细胞占总细胞数>50%；染色深度：0分=没有阳性细胞；1分=大多数阳性细胞显色为黄色；2分=大多数阳性细胞显色棕黄色；3分=大多数阳性细胞显色棕褐色。再将这两项指标相加，总分分成4级：-：0分；+：1～2 分；：3～4分；：5～6分。阳性表达：+、、。阳性表达即淋巴结的切片中出现1个以上的胞膜及胞质内黄染，该淋巴结切片即存在微转移灶。

1.5统计学方法 采用SPSS23.0软件进行t检验，χ2检验。

2 结 果

2.1pN0期NSCLC患者原发癌灶与癌旁组织中PDGFR-B表达比较 pN0期NSCLC组织中PDGF-B阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.001)，见表1。

表1 pN0期NSCLC患者原发癌灶与癌旁组织中PDGF-B表达比较(n)

2.2pN0期NSCLC的淋巴结微转移检测的结果 16/50例pN0期NSCLC患者中检测出现淋巴结的微转移灶；152枚淋巴结中，以CK表达阳性认为淋巴结微转移，CK表达阳性率为28/152(18.42%)。15例病理诊断转移的淋巴结CK表达为阳性表达；2 例良性患者10枚淋巴结表达为阴性。

pN0期NSCLC患者PDGF-B表达与患者的性别、年龄、病程、肿瘤直径及病理类型无显著相关性(P>0.05)，但与临床分期有关，ⅠB期和ⅡB期肺癌的淋巴结微转移发生率明显高于ⅠA期(P<0.05)，见表2。

表2 pN0期非小细胞肺癌患者淋巴结PDGFR-B表达与临床病理因素的关系〔n(%)〕

3 讨 论

肺癌已成为中国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一〔8,9〕。尽管近年来肺癌的诊断和治疗研究已经取得进展，但肺癌的存活率并未显著提高。即使在NSCLC患者接受根治性手术后，复发率仍然很高〔10,11〕，PDGF是广泛分布于人体各种器官中的有丝分裂原及化学趋化剂。PDGF能够通过与其受体PDGFR相结合，进而诱导酪氨酸激酶磷酸化反应的发生，促进内皮细胞的增殖和新血管的形成，并促进肿瘤的继续生长〔12〕。PDGF及其受体在许多恶性肿瘤组织中的高表达在肿瘤的发展中起作用〔13〕。研究证实，PDGFs在促进淋巴管生成中起重要作用。PDGF-B是PDGF家族成员的受体之一，主要在间充质细胞中表达，并在组织生长和发育中起重要作用。目前的研究发现PDGF-B在胃癌基质中的表达与淋巴结转移有关〔14〕。

已经有研究多种肿瘤的发生与进展与 PDGF-B的异常表达密切相关〔15,16〕。人体第22号染色体上的PDGF-B编码基因在正常状态下，很少见其蛋白的表达。有学者研究发现，原癌基因c-sis经过活化后的编码产物与PDGF-B具有同源性〔17〕，PDGF-B的纯合二聚体PDGF-B是具有强的有丝分裂原的作用，并已经证实NSCLC存在c-sis基因被活化的现象〔18〕。PDGF能够促使不同种类的细胞加速增殖与分裂进程，但是这种生物学反应仅在PDGF-B与其受体结合后才能实现。PDGF-B 的受体种类很多，单独PDGFR 来说，它不仅可以与PDGFR-β相结合，也可以和PDGFR-α相结合。曾有学者检测肺癌中的 PDGFR-β的表达情况，结果显示PDGFR-B只能在细胞基质中表达，这说明在NSCLC细胞中PDGF-B高度表达，PDGF-B的表达与肺癌的分化程度之间的关系，国内外文献报道不一致，本实验研究结果显示 PDGF-B的阳性表达与pN0期NSCLC的临床分期有关。有研究发现〔19〕，结直肠癌PDGFR-α染色强度随肿瘤细胞分化程度的增加而增加。PDGFR-α是否在肺癌中发挥作用与结直肠癌相似仍有待研究。

CK是参与细胞质中细胞结构和运动的蛋白质，它广泛存在于上皮组织细胞中，并且在间充质组织如淋巴结，血液和骨髓中缺乏表达。源自上皮组织的NSCLC保留了上皮组织的特征，例如肺腺癌和鳞状细胞癌中CK5、6、8、14、16和19蛋白的强表达〔20〕。只要在常规病理学阴性的淋巴结中检测到CK成分，就可以考虑在NSCLC患者中存在微转移。因此，CK是检测NSCLC淋巴结微转化的敏感和特异性标志物。以前为了能够检测出扩散到远处区域淋巴结中的少量肿瘤细胞，使用了大量连续的切片、HE染色和常规组织病理学检查。该法不仅浪费时间又与实际不相符合。SP染色利用抗原-抗体反应，可以将抗体稀释成千上万倍的浓度。两者均具备检测组织中抗原成分的高灵敏度和特异性。本研究采用SP检测以CK为标志物的肺癌患者淋巴结微转移，这是一种合理的选择。

总之，PDGF-B在NSCLC的发生，发展和分化中起重要作用。毛利伟等〔21〕用同构构建动物模型辐射诱导的方法来抑制肺腺癌的生长方面，并取得了一些进展。Reinmuth等〔22〕也发现体外大黄素可能通过抑制PDCF-B和转化生长因子(TGF)-β1的表达而发挥抗纤维化作用。PDGF-B和PDGFR-α是否可以作为治疗NSCLC的新突破仍有待进一步研究。