DHA诱导胃癌细胞凋亡中MAPKs信号转导通路的作用分析

姚晓媛，宋晓环，王忠超，钟志伟

(长春医学高等专科学校，长春 130031)

二十二碳六烯酸(DHA)为一种ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)。有研究发现，与普通人群相比，长期摄入水平较高的ω-3PUFAs人群，发生恶性肿瘤如结肠癌、乳腺癌的风险较低。越来越多的文献表明，ω-3PUFAs不仅可以对体外肿瘤细胞的增殖进行抑制，还能使小动物体内的肿瘤体积缩小，诱导其凋亡，但尚不明确其作用机制，因此对凋亡诱导过程中凋亡蛋白caspase-3和细胞外信号调节激酶(ERK1/3)的作用进行了探讨，报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

选择人低分化胃腺癌细胞系SGC-7901，由吉林省科学医学院提供，在链霉素100 U/mL+青霉素100 U/mL+10%胎牛血清的RPMI1640培养基中进行常规培养，并研究处于生长期的细胞。

1.2 仪器和试剂

选择美国Beckman Coulter公司生产的Epics-XL型流式细胞仪。试剂包括辣根酶标志的山羊抗鼠二抗、Phospho-ERK、蛋白提取试剂盒、Annexin V/碘化丙啶(PI)试剂盒、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、RPMI1640培养基、10%胎牛血清、DNA。

1.3 方法

1.3.1 MTT法对细胞增殖抑制率进行检测

在96孔培养板上接种细胞悬液，100 μL/孔，经24 h培养，然后将不同DHA作用浓度作为基本依据，设置3组，6孔/组，加入浓度为10、30以及50 μg/mL的DHA，控制好每个孔的体积，一般为200 μl。同时，再设置一个对照组，将培养基加入，经过24 h、48 h以及72 h的平行培养后，将5 mg/mLMTT 20 μL加入，继续进行4 h孵育，弃上清，将150 μL DMSO加入，然后在570 mm波长处，运用酶标仪对每孔吸光度(OD)值进行测定，并对细胞增殖抑制率进行计算。

1.3.2 细胞凋亡率分析

运用DHA 10 μg/mL、30 μg/mL以及50 μg/mL对SCG-7901细胞进行24 h作用后，对1×106个细胞进行收集，经过1次钙缓冲液洗涤后，将10 μL AnnexinV-FITC加入后，在4℃条件下进行20 min静置，采用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.3.3 运用Western blot对细胞凋亡相关蛋白进行检测

在100 mL培养瓶中加入SCG-7901细胞后，在10 μg/mL、30 μg/mL以及50 μg/mL DHA培养基中培养24 h后，将含药培养基弃去，运用预冷的PBS对细胞进行冲洗后，倒尽PBS后吸尽，在冰上放置，然后将含1%PMSF的蛋白裂解液加入，裂解一段时间，一般为30 min，然后刮下细胞，在4℃条件下对上清液进行提取，并且运用BCA法对蛋白质浓度进行测定，对上样量进行计算。同时，运用TBST进行洗涤后，将ECL化学发光剂加入，其中参比蛋白为β-actin，并且在对caspase蛋白和ERKI/2蛋白表达量进行测定时，采用LAS-4000图像软件。

1.4 统计学分析

本数据由SPSS 20.0软件分析，个组间对比经单因素方差分析，采用T检验组间计量资料对比，以P<0.05表示有差异。

2 结果

2.1 DHA抑制SCG07901细胞增殖

DHA可以有效抑制胃癌细胞增殖，并且具有浓度和时间依赖性的特点(P<0.05)，见图1。

图1 DHA可以抑制SCG-7901胃癌细胞增殖

2.2 DHA影响SCG-7901细胞凋亡

对照组的细胞凋亡率为(1.42±0.19)%，而DHA 50 μg/mL、30 μg/mL以及10 μg/mL作用于SCG-7901的细胞凋亡率分别为(14.34±3.11)%、(8.14±2.53)%、(5.29±1.11)%，组间比较有差异(P<0.05)。

2.3 分析P-ERK1/2活性

在DHA实验组和对照组中，ERK1/2的表达相对恒定，但是与10 μg/mL组和对照组相比，DHA 50 μg/mL和30 μg/mL组的ERK1/2活性下降明显，组间对比差异显著(P<0.05)，见图2。

注：1—对照组；2-10μg/ml DHA组；3—30μg/ml DHA组；4—50μg/ml DHA组

2.4 分析caspase-3活性

随着DHA浓度的增加，caspase-3的表达明显升高(P<0.05)，见图3。

图3 caspase-3蛋白表达

3 讨论

近年来，随着人们生活方式和饮食习惯的改变，我国胃癌患者人数明显增加。因为起病隐匿，再加上早期症状不典型，患者不容易察觉，大多数患者在晚期或中期确诊，其预后差，5年生存率低，严重危害患者身心健康。MAPKs作为细胞内的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在多种细胞的外刺激下可以将其激活，其对细胞的凋亡、增殖、分化以及生长控制主要靠信号转导途径实现[1]。有文献报道，细胞的增殖和凋亡与MAPKs信号系统中的ERK1/2信号通路蛋白有关，其中活化的ERK1/2细胞通路蛋白能够将核内的c-Fos、c-Jun等转录因子激活，并且在细胞增殖和转化调控中发挥着极其重要的作用[2]。通常情况下，如果长时间使ERK1/2处于活化状态，可对细胞恶性转化和增殖起到一定的促进作用[3]。有研究发现，DHA不仅能对结肠癌细胞的增殖进行抑制，还可以对ERK1/2信号通路的磷酸化过程进行抑制，说明ERK途径与DHA对SCG细胞增殖的抑制有关[4]。在本研究中，DHA在对SCG-7901细胞凋亡进行诱导时，ERK1/2通路往往处于抑制状态，而DHA与CSG-7901细胞中的P-ERK1/2表达具有浓度依赖性的特点，说明抑制ERK1/2活性，可能是DHA对SCG-细胞增殖进行抑制的一个分子机制[5]。caspase作为白细胞介素-1β的一种转化酶，不仅是凋亡的执行者，也是接受者，并且可以改变细胞形态学，从而导致细胞凋亡[6]。同时，本次研究还发现，caspase-3的表达与DHA浓度的升高呈正比关系，说明DHA在对SCG-7901胃癌细胞进行诱导时，caspase-3的激活是比较重要的一个环节[7]。

综上所述，DHA能够对EPK1/2的磷酸化过程进行下调，将凋亡蛋白caspase-3的表达激活，从而对胃癌细胞凋亡发挥诱导作用。