凯里市大气降尘中可培养微生物群落结构分析研究

李向阳，王 楠，朱小章，杨 蒙

（1.凯里学院，贵州凯里 556011；2.复旦大学，上海杨浦 200433）

0 前言

大气降尘是大气颗粒物的重要组分之一，粒径多在10 µm 到100 µm 之间，主要通过降水的方式并在重力作用下自然沉降于地面或沉积在地球表层［1］.大气降尘来源复杂，可分为人为来源和自然来源，例如，工厂加工过程中产生的工业粉尘、煤尘、地面扬尘、建筑灰尘以及生物界中的花粉、土壤颗粒物及在自然环境中新生成的矿物等［2］.大气降尘对生态环境质量和人体健康具有重要影响，而且它与人体健康效应各终点的流行病学有着密切联系［3-4］.大气降尘在降水和重力作用下，沉降到土壤、地表水等介质中改变土壤的性质，加大水源污染；城市与工业区生产排放出的污染物还能以扬尘或降尘的形势释放到大气环境中，降低空气质量；大气沉降携带的细菌还可以通过呼吸、饮食等方式进入人体，给人体健康带来危害［5-6］.当前对大气降尘的研究主要集中在大气降尘的理化性质、传输机制、时空分布、环境效应等方面，对其生物组分特性了解较少［7］.

凯里作为全国优秀旅游城市，环境空气质量优良天数常年名列前茅.随着一系列大气污染物控制措施及各种相关政策落实，颗粒物现已成为城区的首要污染物.本研究主要通过收集典型的城区（凯里市中心）、工业区（炉山工业园）、清水江边降尘颗粒物样品，分析凯里市大气降尘颗粒物中的微生物组成、浓度及分布特征，在此基础上，通过比对致病菌株数据库分析大气降尘颗粒物中的病原微生物组分，为该地区环境治理及环境质量评价提供数据支撑.

1 材料与方法

1.1 降尘颗粒物的采集

大气降尘微生物群落组成并不稳定，很容易受到周围各种环境因素和其他因素的影响，导致其微生物群落发生改变，特别是气候因素，基于上述考虑，本研究选择在3 月初，微风时期进行样品采集.根据降尘颗粒物的不同来源进行分区采集样品，采样高度距地面1～2 m，采集的位置主要包括公路边的电线杆、公交站台、建筑楼以及窗台.用毛笔刷将不同位置采集到的降尘通过滤纸扫到灭菌好的玻璃瓶中，由于受到实验条件和经费的限制，将该地区采集的样品进行混合鉴定.对城区、工业园区和清水江畔3区域选取采样点信息如下所述.

凯里市城区各街道均有人流量大、交通密集、大型建筑多的特点.根据其交通、人群、植物、食品、建筑、绿化等情况，随机选择5 个采样点，分别是西门中学（26°35′21″N，107°58′19″E）、凯运司（26°35′10″N，107°58′41″E）、苹果山（26°35′11″N，107°58′44″E）、州医院（26°34′59″N，107°58′31″E）和体育馆（26°34′14″N，107°58′26″E）采样点.

工业园区的道路旁（26° 38′35″N，107°46′40″E）、重工业区（26°38′26″N，107°46′42″E）和广场（26°38′35″N，107°46′25″E）3个区域.

清水江畔（下司至镰刀湾段）有下司（26°31′3″N，17°48′30″E）、镰刀湾（26°31′38″N，107°52′47″E）.

1.2 LB培养基

LB培养基组成如下：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂20，调整pH 为7.2，并加入去离子水定容至1 L.

1.3 降尘细菌培养、分离与计数

将城区、工业园区和清水江畔采集到的降尘样品各称取1 g，置于无菌玻璃瓶中，然后加入5 mL 的无菌水放入摇床均匀振荡30 min 后再静置20 min.在超净工作台，经适度梯度稀释后（100、10-1、10-2，、…、10-7）后，取稀释液200 µL 涂布平板，然后置于30 ℃恒温培养箱中倒置培养24～48 h，观察培养皿中不同浓度微生物的生长情况，选取菌落数量在30～300 个的平板进行菌落计数，并根据公式a*5/10-n（a：菌落个数；n：稀释梯度）计算样品中细菌浓度（CFU/g）.所有实验设置3 重复，尽量减少随机误差造成的影响.

1.4 16S rRNA基因测序进行微生物分类鉴定

1.4.1 菌落PCR扩增16S rRNA基因

DNA 模板制备：用牙签从培养后的平板上随机挑取菌落加入到装有50 µL 无菌水的1.5 mL 离心管中，然后采用热激冷冻方法，进行细胞破碎，使细菌DNA 分子破裂释放出水溶液中.具体操作如下：将离心管先放入100℃水浴锅中加热5 min，立即转移至冰水混合物中冰浴5 min，重复上述过程2次，最后12000 r/min离心2 min后备用.

50 µL PCR 扩增体系：2×Taq Master Mix（大连宝生物公司）25 µL，10 µM 27F 引物1 µL，10 µM 1492R引物1µL，DNA模版2µL，ddH2O补足21µL.

PCR 扩增程序：预变性98℃2 min；29 个循环（变性94℃10 s，退火45℃10 s，延伸72℃1.5 min）；72℃5 min；降温25℃5 min；4 ℃保存.

1.4.2 PCR扩增检测及测序

PCR 产物使用1%（M/V）琼脂糖凝胶电泳进行分析，然后送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司（广州）进行纯化及16S rRNA基因测序.

1.4.3 序列分析

将测序结果批量提交至美国国立生物信息技术与中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）16S rRNA基因数据库进行BLASTN（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对分析，并以同源性最高序列（总分最高）作为参照菌株，确定所分析菌落的分类关系.

1.5 致病菌株分析

根据报道的致病菌株数据库［8］，确定致病菌类别.

2 结果与分析

2.1 降尘颗粒物中可培养细菌浓度

经过LB培养基按浓度梯度培养后，观察降尘颗粒物菌落培养皿中不同梯度稀释度涂布平板的生长情况，选取平板中菌株数在30～300的培养皿进行菌落计数，然后对多次计算结果平均值随机计数菌落数量得出3个区域样品中可培养微生物浓度从高到低分别为：城区3.7×107CFU/g，清水江畔3.3×106CFU/g，工业区8.5×105CFU/g.城区作为黔东南州中心，人口相对于后两者密集，交通流量大，初步推断，该区域的降尘颗粒物浓度受人类活动影响较大.

2.2 沉降微生物种类

随机挑取182 个菌株（其中城区样品62 个、工业园区样品60 个、清水江畔60 个）进行16S rRNA基因分析，并将获得的119 个阳性PCR 产物（其中城区样品40 个、工业园区样品37 个、清水江畔42个）进行测序.以BLAST 比对结果最高得分和最大相似度来确定该细菌的属名，结果如表1 所示.从凯里市区沉降中鉴定到的细菌包括芽孢杆菌属（Bacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、考克氏菌属（Kocuria）和两面神菌属（Janibacter）等12 种菌属，其中芽孢杆菌属（22.5%）和节杆菌属（17.5%）为主要优势菌属（图1）；从炉山工业园区分离到马赛菌属（Massilia）、弗里戈里氏菌属（Friedrichia）、冰冻小杆菌属（Frigoribacterium）和副球菌属（Paracoccus）等5 个属，其中马赛菌属为优势菌占，比例高达86.5%（图1）；从清水江畔区域降尘颗粒物中鉴定到微杆菌属（Microbacterium）、芽孢杆菌和考克氏菌属等15个属菌株，其中微杆菌属占42.85%，为主要优势菌属（图1）.

表1 119株细菌16S rRNA基因序列分析结果一览表

续表1 119株细菌16S rRNA基因序列分析结果一览表

续表1 119株细菌16S rRNA基因序列分析结果一览表

图1 凯里市3个典型区域沉降中微生物种类及丰度

2.3 致病微生物种类

经比对人类致病微生物数据库，沉降中包括有芽孢杆菌（Bacillus）、棒状杆菌（Corynebacterium）、假单胞菌（Pseudomonas）和葡萄球菌（Staphylococcus）等潜在致病菌属，特别是最后两类细菌可能会引起气管炎、肺炎和败血症等.这些潜在致病菌主要分布在城区和清水江畔.

3 讨论

本研究采用可培养方法并结合16S rRNA 基因分子鉴定方法，对凯里市城区、工业园区和清水江畔3个典型区域大气沉降中微生物进行培养、纯化分离及种属鉴定，来深入了解凯里市大气沉降颗粒物中可培养微生物群落结构特征.结果显示不同区域的微生物群落存在一定差异，凯里城区的微生物浓度含量最高，炉山工业园区最低；此外，不同区域沉降中可培养微生物种类存在差异，与城区和工业园区相比较，清水江畔沉降细菌种类属数量最高.3 个区域细菌群体丰度和种类差异可能是由不同区域的地理气候等环境差异所致.城区人口密集，机动车辆流动大，因而可能携带更多微生物，最终进入大气沉降中；清水江沿岸植被覆盖率和水含量较高，并且受人类活动影响相对较小，合适的气候、水分和温度等环境更加适应于各种类型细菌生长繁殖，因此微生物种类相对较多；炉山工业园区大多是工厂，人流量小，这些因素可能导致微生物种类偏少.

凯里城区和清水江畔含有芽孢杆菌属、微杆菌属、节杆菌属且含量占比都较高，这与曲浩丽等人［9-10］在研究南京市大气降尘固碳微生物群落多样性和南京市春季不同功能区大气微生物群落结构分析中相一致，测出的芽孢杆菌属、微球菌属等为优势菌属.炉山工业园区检测出的菌属中与其他两个区域的菌种完全不同，并且种类少，发生这种原因很有可能是实验过程中挑取菌株的随机性不够或其他菌落不适合在LB 培养基中生长培养［11］.马赛菌属在工业园区中占绝对优势，这可能与该属菌株广泛分布于土壤、水体、空气中且环境耐受性较强，能够稳定吸附在空气颗粒物中并以气溶胶形式悬浮于大气等因素有关［12］.

目前人类可培养的微生物种类不到微生物总数的1%［13-14］，并且不同微生物对营养组分和生长环境需求差异大，因此本研究采用LB 培养基进行可培养法，并不能完整反映该地区的微生物群落结构总体情况.后续将采用16S rRNA 基因高通量测序方法来进一步解析黔东南州地区大气沉降微生物群落，为深入认识空气质量较好区域大气颗粒物微生物组分提供有用信息.