缢蛏外套膜的组织学和组织化学研究

刘彧成，梁健,2，王培，郑妮，洪敏 ,郭永军,2，李永仁,2

（1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2.天津市海洋牧场技术工程中心，天津 300457）

外套膜分布在两片贝壳内面，是包裹内脏团的薄膜，其背面与内脏团的上皮组织粘连在一起。外套膜分泌形成贝壳的分泌机理一直是研究热点。特别是其外侧紧贴贝壳的珍珠层，可形成珍珠，长期以来备受青睐。缢蛏Sinonovacula constricta 属于双壳贝类，俗称“蛏子”、“青子”，壳较其他贝类脆，生长较快，是一种重要的养殖贝类[1,2]。关于栉孔扇贝Chlamys farrei[3,4]、三角帆蚌Hyriopsis cumingii[5]、池蝶蚌Hyriopsis schlegelii[6]、紫彩血蛤Nuttallia olivacea[7]、文蛤Meretrix meretri[8]等贝类的外套膜已有研究，但缢蛏外套膜的组织学和组织化学研究较少。

本研究采用HE 染色等组织学方法研究缢蛏外套膜的组织结构，采用Gomori 钙-钴法染色、汞溴酚蓝染色和阿利新蓝-PAS 染色方法分析其内在化学构成，旨在从组织结构和细胞内主要成分上找到缢蛏与其他贝类的不同点，为解决缢蛏贝壳易破损、运输中大量死亡等问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用缢蛏取自于天津市王顶堤水产批发市场，平均壳长为（53.24±2.23）mm，暂养于实验室水箱中，选择个体完整、规格相近、活力良好的缢蛏作为实验对象。

1.2 方法

将缢蛏放在解剖盘中，测量和记录壳长、壳宽、壳高和体质量。用手术刀沿外套膜与贝壳交汇处插入，轻轻滑动解剖刀使外套膜与贝壳分离，用剪刀剪取约1 cm 长的外套膜，用贝类生理盐水[8]清洗之后，置于固定液中。外套膜组织较薄，为防止固定时发生蜷缩，先将组织放在滤纸上缓慢滴加固定液，再将组织连同滤纸一同放入固定液中固定。

1.2.1 组织学方法

将组织块在Bouin’s 液中固定12h 后，取出移入70%乙醇中保存备用。脱水剂为叔丁醇，各级脱水时间为1h，常规石蜡包埋，切片厚度6μm，H·E染色，常规方法封片。

1.2.2 组织化学方法

将组织放于Carnoy 氏液中固定，脱水、包埋及切片同上，用改良Gomorri 钙钴法显示碱性磷酸酶（对照组切片于90℃的热水中处理10min 使碱性磷酸酶失活），AB-PAS 染色法显示糖类，汞溴酚蓝染色法显示蛋白质，中性树胶封片。采用Motic BA600-4 数字切片扫描与应用系统高精度扫描切片，用Motic 数字切片助理Lite 1.0 观察组织，采集图片。

2 结果与分析

2.1 组织学观察

组织学观察显示，缢蛏外套膜无边缘膜突起，上、下壳外套膜的边缘膜直接愈合，有明显的愈合点（图版1-ⅰA）。边缘膜（图版1-ⅰB）较厚，颜色深，中央膜较薄，近似透明。

2.1.1 边缘膜

如图版1-ⅱ所示，边缘膜颜色深，较厚，由结缔组织（C）、肌纤维（D）、外侧上皮（E）和内侧上皮（F）组成，还分布有粘液细胞（向下箭头）。

2.1.1.1 外侧上皮

靠近缢蛏外壳一侧的上皮层被称为外侧上皮，主要由单层柱状纤毛上皮细胞（图版1-ⅲ，向右箭头）组成。细胞核位于底部，呈卵圆形，无粘液细胞分布。

2.1.1.2 内侧上皮

靠近缢蛏外套腔一侧的上皮层被称为内侧上皮，主要由单层柱状上皮细胞（图版1-ⅳ，向左箭头）组成；内侧上皮分布着大量细胞核明显的粘液细胞。

2.1.1.3 结缔组织和肌纤维

上皮层下分布的结缔组织十分丰富，主要为疏松结缔组织，内分布有较多肌纤维，肌纤维由内环肌（图版1-ⅴG）和外纵肌（图版1-ⅴH）组成，主要维持外套膜的伸缩，与外套膜的运动相关。

2.1.2 愈合点

缢蛏上壳和下壳的外套膜已愈合，没有其他滩涂双壳贝类所具有的边缘膜突起，这是缢蛏外套膜的特殊之处（图版1-ⅵ）。

2.2 组织化学研究

2.2.1 改良Gomorri 钙钴法显示碱性磷酸酶

缢蛏外套膜边缘膜的外侧上皮细胞经改良Gomorri 钙钴法显示为阳性，细胞内含物有棕褐色沉淀，表明该部位有较强的碱性磷酸酶(ALP)活性（图版2-ⅰ），对照组缢蛏同一部位的上皮细胞显示为阴性，细胞内无棕褐色沉淀（图版2-ⅱ）。而其他部位，实验组和对照组均显示为阴性，细胞内无棕褐色沉淀（图版2-ⅲ和图版2-ⅳ）。

2.2.2 AB-PAS 染色显示糖类

缢蛏外套膜的边缘膜内侧和外侧上皮细胞都被AB-PAS 染成蓝色，说明含有酸性黏蛋白；外套膜边缘内侧的上皮细胞质（图版2-ⅴ，向上箭头）被染成浅紫红色，说明含有少量糖类，分布有中性粘液物质；结缔组织和肌纤维PAS 染色呈阳性，被染成红紫色，染色相对较强，说明糖类含量较多。

2.2.3 汞溴酚蓝染色显示蛋白质

图版1 缢蛏外套膜组织学观察（横切，H·E 染色）Plate 1 Histological observation of mantle membrane of razor clam Sinonovacula constricta （Transversal section,H.E.staining）

图版2 缢蛏外套膜组织化学观察Plate Ⅱ Histochemical observation of mantle membrane of razor clam Sinonovacula constricta

汞溴酚蓝染色法显示，缢蛏外套膜的边缘膜外侧上皮细胞染色较深，说明蛋白质含量较多，内侧上皮染色较浅，说明蛋白质含量较少。而结缔组织染色较浅，说明蛋白质含量较少，肌纤维染色很深，说明蛋白质含量很多（图版2-ⅵ）。

3 讨论

3.1 缢蛏外套膜结构的分析

组织学观察表明，缢蛏的外套膜主要由边缘膜和中央膜组成，但组织结构与双壳贝壳类外套膜基本组织结构的特点有所不同。缢蛏上、下壳外套膜的边缘膜愈合而无边缘突起结构，而文蛤[8]、紫彩血蛤[7]等双壳贝类均有边缘膜、中央膜和边缘膜突起结构。

3.2 缢蛏外套膜粘液细胞的分布

H·E 染色表明，缢蛏外套膜内、外侧上皮分别为柱状纤毛上皮和柱状上皮，外侧上皮细胞间分布一定量的粘液细胞。边缘膜的外侧为单层柱状纤毛上皮，外侧上皮染色比内侧上皮深，因为内侧细胞内有大量的粘液细胞，可以分泌大量粘液物质，说明位于内侧上皮的细胞有一定的分泌功能。边缘膜上皮下有大量泡状疏松结缔组织，其中还分布有大量肌纤维。缢蛏外套膜中含有较多粘液细胞，但是，外套膜不同部位粘液细胞的数量不同，形态也不尽相同。对栉孔扇贝和文蛤的研究发现，外套膜和鳃丝等部位受水流冲击影响较大，含有较多的粘液细胞[10,11]。缢蛏的外套膜中也含有大量粘液细胞，主要分布在外套膜的内侧上皮细胞间，而且在边缘膜处较密集。推测缢蛏的外套膜中粘液细胞的分布情况与外界接触情况有关，即接触越频繁粘液细胞的数量越多。

3.3 缢蛏外套膜中化学物质的分布

组织化学方法显示，在外套膜边缘膜外侧上皮细胞中碱性磷酸酶(ALP)活性较强，其余各部位均无明显反应。背角无齿蚌Anodonta woodiana elliptica外套膜的表皮细胞中，碱性磷酸酶反应很强，结缔组织中只有游走细胞为阳性，其余细胞为阴性，肌细胞活性不明显[12]。AB-PAS 染色法显示：缢蛏外套膜的边缘膜内、外侧上皮均具较少糖类，结缔组织和肌纤维中含有大量糖类。紫彩血蛤外套膜中，外侧上皮含糖量多[6]。汞溴酚蓝染色显示蛋白质法的研究结果则表明，缢蛏外套膜内侧上皮和肌纤维蛋白质含量少，外侧上皮和结缔组织蛋白质含量多。海湾扇贝Argopecten irradians 外套膜同样也富含蛋白质，但是肌纤维和上皮组织含量多，结缔组织中含量少[13]。

3.4 小结

缢蛏上、下壳外套膜的边缘膜愈合，无边缘突起结构。缢蛏的外套膜中粘液细胞的分布与外界接触有关，即接触越频繁粘液细胞分布数量越多。糖类大多分布于结缔组织和肌纤维中，上皮层中分布较少；蛋白质大多分布于外侧上皮和结缔组织中，内侧上皮和肌纤维中分布较少。