复方中草药对白点鲑和亚东鲑抗氧化、非特异性免疫及消化酶指标的影响

孙学亮，杨树元，陈书奇，孟凡亮，陈成勋，郭永军，于宏

（1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2.天津市西青区杨柳青镇农业服务中心，天津 300380；3.天津丰沛水产养殖有限公司，天津 300000）

冷水性鱼类白点鲑Salvelinus pluvius，隶属于鲑科红点鲑属，原产于日本河川、溪流中。白点鲑体呈纺锤型，被很小的圆鳞，体色为青灰色，因体背、侧部有白色斑点而得名[1,2]。亚东鲑Salmo trutta fario系与褐鳟同物异名，是鲑科鱼类中重要养殖种，在西藏亚东地区有分布，为国外引进种[3-5]。随着养殖行业的发展，我国水产养殖规模的逐年扩增，水产药物的使用对环境造成严重污染。在养殖过程中，长期使用抗生素、重金属等大量化学合成药剂既增加养殖动物的抗药性，也会在动物体内残留，危害人类食用健康，因此寻找环保的替代药物尤为重要。

中草药在我国历史悠久，资源丰富，价格低；具有抗微生物、增强免疫力、营养和抗应激作用；不易产生抗药性、无残留、副作用小、不污染环境。研究证明：中草药可以提高机体免疫力，防治疾病有很好疗效[6-9]，现正逐渐受到重视和青睐[10,11]。

本试验遵循中药配伍原则，在基础饲料中添加0.5%复方中草药（大黄、黄芪、连翅、黄苓和丹皮），通过研究复方中草药对白点鲑和亚东鲑的影响，旨在为复方中草药在水产养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用健康白点鲑及亚东鲑取自天津市丰沛水产养殖有限公司，平均体质量分别为（224.14±26.73）g 和（152.12±7.46）g。

将购于当地中药房的大黄、黄芪、连翅、黄苓和丹皮先分别用粉碎机超微粉碎，再过120 目钢筛，最后按等比例混合均匀制成复合中草药，干燥通风处存放备用。

1.2 方法

1.2.1 饲料制备

本试验用的基础饲料为丹麦艾乐牌鱼类配合饲料，其营养组成为粗脂肪15%、粗蛋白45%、无氮浸出物21.9%、灰分6.9%、粗纤维3.3%、Na 0.2%、P 0.9%和Ca 0.8%。每kg 矿物质预混料含：Zn 70 mg、Cu 5 mg 和Mn 12 mg。每kg 维生素预混料含：VD 1000 IU、VE 200 mg 和VA 10000 IU。首先将基础饲料用粉碎机超微粉碎过100 目筛，再按0.5%的比例添加复方中草药（大黄、黄芪、连翅、黄苓和丹皮），混合均匀后用制粒机制成颗粒料，干燥通风处存放备用。

1.2.2 饲养管理

将白点鲑和亚东鲑用基础饲料驯养2 周后，选择健康无伤和规格统一的鱼随机分成10 组，每组3个重复，每个重复30 尾。用添加0.5%复方中草药后的饲料投喂，日投喂量为鱼体质量的1%，以全部摄食为准，每天投喂2 次。每天清理池底一次，日换水量不超过水体1/3。试验期间，24 h 曝气，水温10～12℃，pH6.5～7.5。溶氧量不低于7.0 mg/L，投喂试验持续28 d。

1.2.3 样品采集

在投喂0d、7d、14d、21d、28d 时，每次各组所有平行均分别随机采集5 尾，记录每尾鱼体质量和体长，注射器吸取少量肝素后从鱼尾柄腹侧处抽血。先将抽出的血放入离心管中，于4℃下离心10 min，取上清液放入干净的离心管中，做好标记于-80℃冰箱中保存。抽血后立即解剖，取肠道放入离心管中，做好标记后装入封口塑料袋，于-80℃冰箱中保存。测定时，准确称量组织后，按1∶9 的比例添加生理盐水，用高通量组织研磨器研磨10 min 后，用低温高速离心机4℃离心10 min，取上清液测定各指标。

1.2.4 样品测定

SOD、CAT、T-AOC、AKP、ACP、溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性及MDA 和NO 含量均采用南京建成生物工程技术研究所的试剂盒，按说明书进行测定。

1.3 数据处理与统计分析

本试验数据用平均值±标准差（Mean±SD）表示。用Excel 2003 及SPSS18.0 进行统计分析和单因素方差分析（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1 复方中草药对亚东鲑抗氧化指标的影响

由表1 可知，摄食含复方中草药饲料21d 时的亚东鲑血液T-AOC 活力显著高于0d 和28d（P＜0.05），7d、14d 和21d 间差异不显著（P＞0.05）；MDA 含量差异不显著（P＞0.05）；14d 时SOD 活力显著高于0d 和7d（P＜0.05），14d、21d 和28d 时差异不显著（P＞0.05）；CAT 活力差异不显著（P＞0.05）。

2.2 复方中草药对白点鲑血液抗氧化指标的影响

由表2 可知，摄食含复方中草药饲料14d 的白点鲑血液T-AOC 活力显著高于其他组（P＜0.05），0d 与7d 差异不显著（P＞0.05）；MDA 含量差异不显著（P＞0.05）；SOD 活力差异不显著（P＞0.05）；21d 时CAT 活力显著高于其他组（P＜0.05），其他组之间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 复方中草药对亚东鲑血液非特异性免疫指标的影响

复方中草药对亚东鲑血液非特异性免疫指标的影响结果见表。由表3 可知，摄食含复方中草药饲料7d 和14d 的亚东鲑血液AKP 活力显著高于其他组（P＜0.05），14d 与0d 时差异显著（P＜0.05）；7d和14d 时ACP 活力显著高于其他组（P＜0.05），14d与0d 时差异显著（P＜0.05）；14d 时NO 浓度在显著高于其他组（P＜0.05）；14d 时LZM活性与0d 差异显著（P＜0.05），与7d、21d 和28d 差异不显著（P＞0.05）。

2.4 复方中草药对白点鲑血液非特异性免疫指标的影响

由表4 可知，摄食含复方中草药饲料的白点鲑的AKP 活力差异不显著（P＞0.05）；7d、14d 和21d 时ACP 活力显著高于其他组（P＜0.05），0d 与其他时间段差异显著（P＜0.05）；NO 浓度在7d 和14d 显著高于其他组（P＜0.05）；21d 时LZM 含量显著高于其他组（P＜0.05），0d、7d 和14d 时差异不显著（P＞0.05）。

表1 复方中草药对亚东鲑血液抗氧化指标的影响Tab.1 Effects of compound Chinese herbal medicine on blood antioxidant indicators in salmon Salmo trutta fario

表2 复方中草药对白点鲑血液抗氧化指标的影响Tab.2 Effects of compound Chinese herbal medicine on blood antioxidant indicators in charr Salvelinus pluvius

2.5 复方中草药对亚东鲑肠道消化酶指标的影响

由表5 可知，摄食含复方中草药饲料的亚东鲑肠道蛋白酶活力差异不显著（P＞0.05）；淀粉酶活力在14 d 显著高于其他组（P＜0.05）；14 d 时脂肪酶活力在显著高于其他组（P＜0.05），7 d 和14 d 差异不显著（P＞0.05）。

2.6 复方中草药对白点鲑肠道消化酶指标的影响

由表6 可知，摄食含复方中草药饲料的白点鲑肠道蛋白酶活力差异不显著（P＞0.05）；14 d 时淀粉酶活力显著高于其他组（P＜0.05），其他组差异不显著（P＞0.05）；脂肪酶活力差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 复方中草药对亚东鲑和白点鲑血液抗氧化指标的影响

血液是反应机体免疫代谢等的重要组织。血液中的SOD、CAT、MDA 和AOC 是评价机体抗氧化能力的重要指标。SOD 和CAT 是机体内清除自由基的关键酶，MDA 是反映机体过氧化和损伤程度的常用指标，T-AOC 是反映机体内总抗氧化酶和抗氧化物质水平的重要指标。吴彬[12]研究表明，饲料中添加黄芩、金银花、板蓝根、黄芪可以显著提升吉富罗非鱼Oreochromis niloticus 幼鱼的SOD 和CAT 活力。张照红[13]研究表明，添加复方中草药可以显著影响罗非鱼和草鱼Ctenopharyngodon idellus 的抗氧化能力。本试验结果表明，14d 时亚东鲑SOD 活力显著高于0 d，这与孙学亮等[14]对复方中草药促进山女鳟Oncorhynchus masou masou、白点鲑和亚东鲑肝脏的SOD 活力的研究结果一致，也与谭娟等[15]对复方中草药对草鱼幼鱼的SOD 影响的研究结果一致。在7d、14d 和21d 时，亚东鲑AOC 活力与0d 差异显著，在21d 时较显著，14d 时白点鲑AOC 活力显著高于0d，这与崔惟东等[16]研究的虾青素和角黄素对虹鳟肌肉着色和肝脏总抗氧化能力的影响结果一致。在21d 时白点鲑CAT 活力显著高于0d，与史玮琪[17]对饲料中添加复方中草药能一定程度促进吉富罗非抗氧化能力的研究结果一致。综上所述，复方中草药可以提高亚东鲑和白点鲑的抗氧化能力，但是，活力达到最高后下降。这说明复方中草药对白点鲑、亚东鲑具有双向调节作用，适量添加有促进动物机体免疫的作用，而过量添加会产生一定的负作用。

表3 复方中草药对亚东鲑血液非特异性免疫指标的影响Tab.3 Effects of compound Chinese herbal medicine on blood non-specific immune indicators in salmon Salmo trutta fario

表4 复方中草药对白点鲑血液非特异性免疫指标的影响Tab.4 Effects of compound Chinese herbal medicine on blood non-specific immune indicators in charr Salvelinus pluvius

表5 复方中草药对亚东鲑肠道消化酶指标的影响Tab.5 Effects of compound Chinese herbal medicine on activities of digestive enzymes in digestive tract of salmon Salmo trutta fario

表6 复方中草药对白点鲑肠道消化酶指标的影响Tab.6 Effects of compound Chinese herbal medicine on activities of digestive enzymes in intestine of charr Salvelinus pluvius

3.2 复方中草药对亚东鲑和白点鲑非特异性免疫指标的影响

鱼类虽为低等动物，但具有较完善的免疫系统。溶菌酶（LSZ）是鱼类非特异性免疫的第一道屏障，是一种具有抗菌活性的水解酶，能溶解细胞壁使细胞破裂，对革兰氏阳性菌有溶菌的作用[18]。测定鱼体的LSZ 活力，可以在一定程度上反映鱼类非特异性体液免疫状态[19]，是非常重要的非特异性免疫评价指标之一。NO 可直接进入靶细胞与酶结合作用于平滑肌使血管扩张[20]，一定程度上增强鱼类的免疫力。酸性磷酸酶是吞噬溶酶体的重要组成部分，主要参与磷酸酯的代谢，在鱼类体内更是溶酶体的标志酶[21]，具有调节代谢及信号传导等功能。碱性磷酸酶一种膜结合蛋白，在钙磷分泌和吸收中，尤其是免疫反应中发挥重要作用[22,23]。本研究表明，14d 时亚东鲑的LSZ 活力显著高于0d；21d 白点鲑LSZ 活性在显著高于0d、7d、14d，与其他组差异不显著。这与Zhang 等[24]和Tang 等[25]用添加2 种复方中草药提取物的饲料投喂胭脂鱼Myxocyprinus asiaticus 和罗非鱼能显著提高鱼血清中LSZ 活性的结果一致。亚东鲑AKP 活力在7d 和14d 时显著高于其他组，ACP 活力在7d 和14d 时显著高于其他组，白点鲑ACP 活力7d、14d 和21d 显著高于其他组，0d 与其他组差异显著，这与马维波[26]对复方中草药能提升香鱼Plecoglossus altivelis 机体内ACP 和AKP 酶活力的研究结果一致。NO 浓度在7d 和14d显著高于其他组，这与孔江红[27]的研究结果一致。其研究结果表明，两种复方中草药能提高斜带石斑鱼Epinephelus coioides 非特异性免疫功能。综上所述，复方中草药可以提高亚东鲑和白点鲑非特异性免疫能力，但是这些指标都在达到最显著之后开始下降，说明复方中草药对白点鲑和亚东鲑非特异性免疫有双重调节作用，过量添加会产生副作用。

3.3 复方中草药对亚东鲑和白点鲑肠道消化酶活性的影响

本研究表明，亚东鲑和白点鲑肠道淀粉酶活力在14d 显著高于其他组；白点鲑脂肪酶活力在14d显著高于0d、21d 和28d，这与相关研究结果一致。刘慧吉等[28]的研究表明：饲料中添加复方中草药可以显著提高花鲈Lateolabrax maculatus 肠道淀粉酶和蛋白酶的活力。文国樑等[29]研究发现，复方中草药可以提高凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei 的淀粉酶和蛋白酶活力。李金龙等[30]研究发现，在饲料中添加中草药可显著提高黄鳝Monopterus albus 淀粉酶和蛋白酶活性。但是，鱼类肠道消化酶活性与中草药的品种、养殖动物的种类、生长阶段、饲料组成及营养水平等有关。

3.4 结论

给亚东鲑和白点鲑投喂添加复方中草药的饲料28 d 后表明：（1）投喂14 d 时，亚东鲑血液抗氧化能力、非特异性免疫及消化酶指标明显提高，其中SOD、AKP、ACP、NO 和淀粉酶差异显著；（2）投喂14 d 时，白点鲑血液抗氧化性、非特异性及消化酶指标明显提高，其中SOD、ACP、T-AOC 和淀粉酶活性差异显著。

综上所述，投喂添加0.5%复方中草药的饲料，对白点鲑、亚东鲑血液抗氧化能力、非特异性免疫及消化酶指标有促进作用，投喂14 d 时效果最佳。