linc00673在结直肠癌患者血浆中的表达及临床意义

张世派 李君宇 邹小红 黄凯斌 钟思梅 傅宇翔 夏利刚

1 暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)胃肠外科 广东 深圳 518020；2 深圳市宝安区中心医院药学部

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)在全球范围内是发病率和死亡率均排名前三的恶性肿瘤[1]。虽然近年来随着医疗技术和辅助疗法的进一步发展，患者的生活质量得到了极大的提高，但由于其早期无明显症状，致使多数患者诊断时已为中晚期，导致其5年生存率低于12%[2]。因此，开展CRC早期筛查对于患者的早诊早治以及改善患者的预后有极其重要的意义。目前血清肿瘤标志物检测和肠镜是应用最为广泛的CRC癌筛查手段，但由于敏感度低、特异性差及患者依从性差等问题，制约了CRC患者的早期诊断[3]。近年来，随着“液体活检”技术的发展，从血液中寻找新的CRC无创标志物已成为广大科研工作者关注的热点领域[3-4]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸，且不具备编码蛋白能力的RNA[5]。大量的研究证实lncRNA在肿瘤的发生、发展、转移及耐药等多个过程中均发挥着重要的作用[6]。此外，研究还发现多种lncRNA在肿瘤患者血浆中的表达出现异常，且与肿瘤的不良预后密切相关[7]。在本研究中，采用荧光定量PCR技术对入组的结肠息肉和CRC患者血浆中linc00673水平进行检测，并结合患者早期病变不同分期及肿瘤临床病理分析linc00673水平差异与临床的相关性，旨在为血浆linc00673在CRC早期筛查中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本收集 收集某院2018年6月至2018年12月期间收治的结肠息肉、CRC住院患者，入组情况见表1。其中结肠息肉患者42例，男性28例，女性14例，年龄26～76岁，平均年龄(51.6±16.1)岁；患者按病变性质分类，其中炎性/增生性息肉21者例，非进展期腺瘤者11例，进展期腺瘤者10例。CRC患者66例，男性39例，女性27例，年龄39～82岁，平均年龄(55.3±13.9)岁；CRC患者按UICC/AJCC第7版标准进行分期，其中Ⅰ期10例，Ⅱ期21例，Ⅲ期28例，Ⅳ期7例。上述肿瘤分期及病理分型均经过病理组织学和细胞学检查证实。所有研究对象排除近期大手术、放化疗、长期慢性炎症、严重感染等情况，且已签署知情同意书。

表1 入组患者情况

1.2 试剂及仪器 miRNeasy Serum/Plasma kit购于Qiagen公司；Reverse transcription kit、EmeraldAmp®PCR Master Mix、TB Green qPCR kit 购于Takara公司；Qubit RNA BR Assay Kits购于Bio-rad公司，-80℃超低温冰箱，Qubit 3.0荧光计，Bio-rad CFX Connect荧光定量PCR仪。

1.3 实验方法

1.3.1 样本血浆 分离抽取外周血样本2 mL，置于含EDTA的抗凝管中，低温运输至实验室。4℃，1 000 g，离心10 min。将血浆(上清)转移至冻存管中，于-80℃保存。

1.3.2 血浆总RNA提取参照miRNeasy Serum/Plasma kit试剂盒说明书。血浆溶解后，4℃，12 000 g离心10 min，将上清转移至新EP管内。加入血浆RNA裂解液1 mL，涡旋震荡，室温孵育5 min。加入等体积氯仿，剧烈震荡15 s，室温孵育3 min后，4℃，12 000 g，离心15 min。移取上清液至新EP管中，加入1.5倍体积的无水乙醇，反复吹打混匀后。转移至RNA分离柱，室温，8 000 g，离心15 s，将RNA吸附至柱膜上。向上述RNA分离柱中加入RNA洗涤缓冲液I，室温，8 000 g，离心15 s后，加入RNA洗涤缓冲液II，室温，8 000 g，离心15 s。加入500 uL 80%乙醇，室温，8 000 g，离心2 min。将柱子转移至新的2 mL收集管，以最大的离心力离心5 min。打开管盖，干燥15 min后，用15 uL RNase-free H2O洗脱RNA。

1.3.3 RNA定量参照Qubit®RNA BR Assay Kits进行RNA定量。配制工作液，将工作液分装标准液和样本测定Qubit管中，标准液管中分别加入对应的标准液10 uL，样本测定管中，加入1～20 uL测定样品，使管内总体积达到200 uL。混匀，室温孵育2 min，上机检测。

1.3.4 引物序列 Actin上游引物5′-GTACGCCAACACAGTGCTG-3′，下游引物5′-GCCATGCCAATCTCATCTTG-3′。Linc00673上游引物5′-TACCACACCCTTTCTTGCCC-3′，下游引物5′-ACACTGGCCTCTTTACACGG-3′。

1.3.5 荧光定量PCR检测逆转录反应体系如表2，反应程序为37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃∞。

表2 逆转录反应体系

荧光定量PCR反应体系如表3，反应程序为95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。

表3 荧光定量PCR反应体系

2 结果

2.1 Linc00673在结肠息肉和结直肠癌患者中的水平 采用相对定量PCR法检测入组样本血浆中linc00673的表达水平，结直肠癌患者血浆中linc00673表达水平明显高于结肠息肉患者(P<0.05)，为结肠息肉患者的3.7倍，如图1A所示。而炎性/增生性息肉、非进展期腺瘤和进展期腺瘤结肠息肉患者组间差异无统计学意义(图1B)。此外，结直肠癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者血浆中linc00673水平差异无统计学意义(图1C)。

2.2 Linc00673与结直肠癌临床病理相关性分析 结直肠癌患者在年龄、性别、TNM肿瘤分期、肿瘤部位、大体形态和淋巴结转移方面与血浆linc00673水平组间比较差异无统计学意义(表4)，但linc 0067水平与肿瘤体积大小呈正相关(r=0.535 4，P<0.01)。

3 讨论

CRC属于消化道常见肿瘤。据《2016中国肿瘤登记年报》显示，我国CRC占全部恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率居第五位。绝大多数患者在确诊时已为晚期，致使CRC患者5年生存率较低，因此“早发现、早治疗”成为提高CRC患者生存质量的关键。由于目前临床使用的早期筛查方式都存在着各自的缺点，使得无创、快捷、准确可重复的检测技术成为肿瘤早期筛查研究领域的热点。“液体活检”技术在2015年被《麻省理工大学科技评论》评为最可能改变世界的十大科技，被认为有助于尽早发现癌症。越来越多的证据表明lncRNA不仅在CRC的发生、发展过程中起着重要的作用[8]，同时还能稳定存在于体液中(例：血液，血浆，血清等)[7]。基于以上特点，血浆lncRNA有望成为CRC早期诊断、预后判断和疗效预测的无创分子标志物。

基因间长链非编码RNA 00673(linc00673)隶属于lncRNA，定位于染色体 17q24.3 区域，在多种肿瘤中发挥着癌基因的作用[9]。研究证实其在肺癌[10]、乳头状甲状腺癌[11]、胰腺癌[12]、乳腺癌[13]、神经胶质瘤[9]、肝癌[14]等肿瘤组织中高表达。但其在CRC早期诊断中的研究还未见报道。

表4 CRC临床病理与血浆linc00673相关性

我们采用相对定量PCR法检测结肠息肉和CRC患者血浆中linc00673的表达水平后，发现CRC患者血浆中linc00673表达水平明显高于结肠息肉患者(P<0.05)，而在结肠息肉不同病理组间和CRC不同分期组间却无显著性差异，提示血浆linc00673可能与CRC的发生密切相关。经与CRC病理进行相关性分析，CRC患者血浆中linc00673水平与患者年龄、性别、TNM肿瘤分期、肿瘤部位、大体形态和淋巴结转移无关，仅与患者肿瘤大小呈正相关，说明血浆中linc00673表达水平与CRC肿瘤的发展有紧密联系。因此，综合分析血浆linc00673在不同病理阶段下的表达水平，及与肿瘤病理之间的关系，血浆linc00673有可能是CRC早期诊断的潜在标志物。