体外产气法评定耐重金属饲料桑的饲料价值

黄江丽，何 力，计少石，张志红，彭 建，丁建南，张华琦，圣 平*

(1.江西省科学院生物资源研究所，330096，南昌；2.乐平市三王牧业有限公司，333300，江西，景德镇)

0 引言

我国多目标区域地球化学调查项目已发现我国局部地区土壤重金属污染严重。江西有色金属矿产丰富，重金属污染的背景值本来就高，是我国重金属污染最为集中的地方之一。为遏制新的污染，并对历史上累积在土壤中的重金属进行有效治理，科学家努力寻找各种缓解或修复重金属污染的技术，目前利用超高富集重金属植物缓解和修复重金属污染土地成为研究热点。据湖南省蚕桑科学研究所的研究，桑树是镉等重金属高吸附植物，可作为重金属污染农田耕作改制的重要选择品种：镉等重金属主要沉积在桑树的根和茎干，而枝叶的沉积量很低，其含量符合国家饲料卫生标准(GB13078-2017)。该分布特点表明，根茎中的重金属可通过工业回收利用，不会形成二次污染，对于修复重金属污染土地将发挥重要作用；而桑叶作为畜禽饲料也是安全的。因此，种桑治污、种桑喂畜，可谓一举两得，可产生巨大的经济效益、社会效益和环境效益。

我国科研人员通过人工选择与杂交育种，培育出的抗逆性品系——饲用桑目前已被广泛用于猪、牛、羊、鸡等动物的饲养。饲料桑是一种产量高，营养丰富，饲用价值大，极具开发潜力的功能性饲料资源。有研究表明，鲜桑叶干物质含量约25%，其干物质中的粗蛋白含量可达16%～30%，与大多数豆类牧草的蛋白质含量相近，且其氨基酸含量较高，种类丰富，可作为一种良好的蛋白质饲料。经引种试验发现，饲料桑在湖南红黄壤地区长势良好，具有很好的推广价值[1]。但利用在污染区种植饲料桑饲喂牛的报道较少，亦未见其对肉牛瘤胃的发酵特性的报道。李文娟[2]等采用体外产气法评定了桑叶的饲用价值，为其作为反刍动物粗粮提供了依据，本研究采用体外瘤胃发酵法研究饲料桑粉与牛用全价精料的瘤胃发酵特性，为饲料桑粉代替牛用全价精料的研究开发提供理论依据，同时为缓解重金属污染的同时，开发一种蛋白质饲料资源，为其在养牛生产中的应用提供理论依据，可为我国反刍动物的饲养节约成本，对解决“人畜争粮”矛盾具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料及其成分测定

饲料桑粉的制备：于种植丰产期采集距离地面1 cm的桑叶(三倍体饲料桑)，将叶片于65℃烘干24 h，在室内空气中回潮24 h，称重粉碎，过40目筛，置于阴凉处储存待分析。

干物质、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、重金属含量等常规样品成分分析在实验室条件下进行测定，测定方法参照《饲料分析及饲料质量检测》第3版的方法[3]。

1.2 试验动物及其饲养管理

选取3头健康，装有永久性瘤胃瘘管的成年广丰黄牛为试验动物，体重350±20 kg，驱虫，预饲期2周，试验日粮精粗比6:4，试验牛的日粮组成(见表1)，每天喂料2次(07:30和16:30)，自由饮水，单槽饲养。试验期于晨饲前采集瘤胃液。

表1 试验动物日粮组成

注：每千克预混料含维生素 A50 万、维生素 D38万和维生素E2000 IU、烟酸 80、Cu2、Fe10、Mn8、Zn6、Se0.02、I0.1和Co0.02 g。

1.3 试验方法

体外法测定饲料桑粉与牛用全价精料的瘤胃液发酵特性。试验设1个空白组(编号为CK)和2个试验组，每组12个重复。对照组不添加底物，试验1组以2 g饲料桑粉为底物，编号为ST；试验2组以2 g牛用全价精料为底物，编号为JT。

表2 试验设计方案

本试验方法采用Mauricio[4]等的压力读取式体外产气系统进行体外瘤胃发酵培养。厌氧人工瘤胃缓冲液的配制按Menke[5]等的方法配制。

在试验当天晨饲前抽取3头瘘管牛的瘤胃液放入保温瓶内并迅速带回实验室，以防止微生物区系发生改变。正式试验前将瘤胃液混合均匀后经4层纱布过滤，量取所需体积(瘤胃液与人工瘤胃营养液的体积比为1:2)的瘤胃液迅速加入到准备好的人工瘤胃液营养液中，制成混合人工瘤胃培养液。混合人工瘤胃培养液通入无氧CO2，同时边加热边用磁力搅拌器搅拌，调节pH至6.9～7.0后，39℃水浴30 min。水浴完成后，用手动分液器向每个已准备好底物的培养瓶中分别加入50 mL上述培养液，通无氧CO2排尽培养瓶内氧气后迅速盖好盖子并密封。混匀培养瓶中底物，置于39℃恒温培养箱中开始培养，记录起始时间。整个操作过程应保证在厌氧条件下进行。当培养至0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h各时间点时，取出培养瓶，用压力读取器快速读取瓶内压力并记录。读数后及时排气至培养瓶压力为0。

1.4 培养终止并取样

在体外培养条件下培养12 h和24 h时，在这2个时间点每个处理包括空白组各拿出6个培养瓶快速放入冰水浴中停止发酵。中止发酵后将培养瓶拿出恢复到室温后用pH计测定发酵液pH值。每个点取3瓶用来测干物质消失率，另3瓶取发酵液经低温离心(4℃、8 000 g、15 min)，取上清液冷冻保存以备测其它发酵参数(BCP、VFA、NH3-N)的测定。

1.5 发酵参数测定

体外发酵产气量测定参照Mauricio[4]等方法。当培养至0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h各时间点时，取出培养瓶，用压力读取器快速读取瓶内压力并记录。读数后及时排气至培养瓶压力为0。

产气量计算公式：

式中：GPt为样品在t时间段的产气量(mL)；Pt为t时间段读取的压力(kPa)；V0为瓶子体积；101.3为标准大气压(kPa)；W为样品干物质重。产气过程的总积累产气量为各时间段产气量之和。

发酵液的pH值直接由pH计测定。

培养液用纱布过滤，滤渣无损失地转移入100 mL大坩埚中，65℃烘干，测定干物质降解率。干物质消化率(DM，%)=(样本DM重-残渣DM重+空白管DM重)/样本DM重×100。

菌体粗蛋白(BCP)含量测定参照Zinn[6]等分步离心法进行样品的预处理，取经预处理去除原虫和饲料大颗粒的上清液10 mL，以16 000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀的细菌部分加以9 mL、10%三氯乙酸溶液，混匀，再以4 000 r/min离心10 min，取沉淀物加少量5%氢氧化钠溶解后稀释至25 mL。此稀释液又经4 000 r/min离心10 min，取上清液在紫外分光光度计上用280 nm和260 nm波长进行比色。细菌蛋白含量计算公式如下：

细菌蛋白质含量(mg/mL)=(1.45×D280-0.74×D260)×稀释倍数。

氨态氮(NH3-N)测定参照冯宗慈等的比色法进行测定[7]。

挥发性脂肪酸(VFA)测定参照秦为琳的方法[8]。

1.6 数据统计分析

试验数据采用EXCEL2003整理，运用SPSS18统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行统计分析，差异显著则用DUNCAN法进行多重比较。当P<0.05时为差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲料桑粉营养成分分析

由表3可看出，饲料桑粉的干物质为91.38%、粗蛋白质18.29%、粗脂肪1.32%、粗纤维21.4%、钙2.33%、总磷0.16%、粗灰分13.84%和总能为15.85 MJ/kg。其中干物质含量、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、钙均比相同质量的牛用全价精料中含量高，二者的总能则基本无差异。由此可知，饲料桑综合营养比牛用全价精料要高。

表3 饲料桑营养成分(风干基础)

2.2 饲料桑粉安全性评价

从表4可以看出，饲料桑粉中铬含量为4.32 mg/kg，镉含量为0.40 mg/kg，均在国家饲料卫生标准GB13078-2017规定范围内，说明供试饲料桑粉作为饲料是安全的。

表4 饲料桑粉安全性评价指标)

2.3 饲料桑粉和牛用全价精料对体外培养发酵产气量、pH、菌体蛋白及氨态氮指标的影响

ST组(饲料桑)在发酵时间点2 h、4 h、12 h时产气量均显著高于JT组(牛用复合精料)的产气量(表5)，但是时间点8 h、24 h时ST的产气量略低于JT组，但无显著差异；ST组在0-8 h为产气量上升最快的时间段，8 h之后产气量增长速度减慢，12-24 h趋于平缓；JT组在0-2 h产气量较少，2-8 h为产气量上升最快的时间段，8 h之后产气量增长速度减慢，12-24 h趋于平缓。而饲料桑的12 h、24 h的累计产气量均显著高于牛用全价精料产气量(P<0.000 1)。

表5 饲料桑粉和牛用全价精料体外瘤胃发酵情况

项目时间/h不同处理组STJTP产气量/mL217.77±8.39a9.87±0.71b<0.01426.49±0.91a17.89±0.90b<0.01838.94±0.9839.13±0.190.571221.22±0.50a18.60±0.56b0.012413.08±0.3714.35±0.620.1612 hT12 h累积产气量104.02±1.76a85.50±1.14b<0.0124 hT24h累积产气量115.06±0.52a97.96±0.39b<0.01pH125.55±0.01a4.78±0.02b<0.01245.41±0.01a4.63±0.01b<0.011干物质消失率/%1254.08±0.72b61.93±0.58a0.042456.30±0.26b62.97±0.12a0.01菌体蛋白/mg·mL-1123.55±0.03a1.91±0.04b<0.01243.08±0.232.51±0.170.12氨态氮/mg·dl-11211.54±0.60a3.88±0.30b<0.012416.16±0.92a6.57±0.33b0.01

从表5可以看出，ST组与JT组的发酵液的pH在12 h、24 h均存在显著差异，即ST组的pH显著高于JT组。ST组发酵液的pH在12 h、24 h时为5.55±0.01、5.41±0.01，接近正常瘤胃液pH值范围5.5～7.5，而JT组发酵液的pH在12 h、24 h时为4.78±0.02、4.63±0.01，则显著降低了发酵液的pH值，说明饲料桑粉对瘤胃液pH值波动负面影响较牛用全价精料显著偏低。

ST组的干物质消失率在12 h、24 h时均显著低于JT组的干物质消失率，这应该是与饲料桑粗纤维含量显著高于牛用全价精料之故。

ST组在发酵12 h时，发酵液菌体蛋白含量显著高于JT组发酵液中的含量；而到发酵24 h时，其菌体蛋白含量稍高于JT组发酵液中的含量，但不存在显著性差异。

ST组发酵液中氨态氮含量则在12 h、24 h时均显著高于JT组发酵液中的氨态氮含量。

2.4 饲料桑粉和牛用全价精料对体外培养发酵挥发性脂肪酸的影响

从表6中可以看出，发酵到12 h时，ST组发酵液中乙酸、丙酸、丁酸及总挥发性脂肪酸含量在发酵到12 h时，略低于JT组发酵液中的含量，但均无显著差异；而发酵到24 h时，ST组发酵液中乙酸、丙酸、丁酸及总挥发性脂肪酸含量显著低于JT组的含量，乙丙比(乙酸/丙酸)则在发酵12 h、24 h时两者均无显著差异。ST组在发酵过程中，乙酸、丙酸、总酸含量在24 h均比12 h时降低近一半，而丁酸含量则从1.17±0.05增加到4.78±0.57；JT组发酵液的乙酸、丙酸、总酸含量在24 h时均比12 h增加近1倍或1倍以上。

表6 饲料桑粉和牛用全价精料体外瘤胃发酵情况

项目时间/h不同处理组STJTP乙酸/mmol·L-11263.69±3.8080.80±14.880.332436.94±3.18b146.50±1.08a<0.01丙酸/mmol·L-11222.79±1.5926.49±1.340.1512412.46±0.53b51.96±1.48a<0.01丁酸/mmol·L-1121.17±0.051.67±0.270.14244.78±0.57b16.48±1.61a0.00总挥发性脂肪酸TVFA/mmol·L-11287.64±4.89108.96±15.530.262454.18±2.32b214.94±1.69a<0.01乙酸/丙酸122.81±0.163.03±0.500.69242.99±0.372.82±0.080.68

3 讨论

3.1 饲料桑的营养成分及安全评价

已有调查研究表明，在不同地区、不同生长季节、不同品种、不同种植方式等条件下的桑叶营养成分差异较大。据相关文献报道[9]，桑叶中粗蛋白含量 16%～30% ，粗纤维 8%～12%，粗脂肪4%～10% ，灰分 8%～12% ，磷0.3%～0.6%，钙 1%～3%。桑叶中还含有非特异性抗菌成分，能提高机体免疫能力、抗菌等作用[10]，桑叶作为饲料也无抗药性，能激发机体抗病因子，不引发病菌变异，故桑叶饲料能增强动物机体新陈代谢，促进蛋白质和酶的合成，促进动物体生长，提高繁殖力和生产性能。本研究采用的原料为在重金属污染土地上种植的饲料桑桑叶。粗蛋白含量偏低，粗纤维含量则明显偏高，有可能与桑叶采摘时间，长在特殊土壤等相关，具体原因有待进一步研究分析。尽管该饲料桑种植在重金属污染的土壤上，其桑叶的重金属含量符合饲料原料标准。可见，饲料桑在治污、喂畜上发挥其作用，并在一定程度上缓解人畜争粮的矛盾。

3.2 饲料桑和牛用全价精料体外瘤胃发酵特性

产气量是衡量饲草营养价值的重要指标，是一个综合反映饲料中有机物可发酵程度的指标，体外发酵产气量则反映了底物被瘤胃微生物利用的程度，与饲料中碳水化合物消化率高低有关，是评价反刍动物瘤胃发酵的一个重要指标。本试验中两种饲料样品体外发酵产气量动态变化曲线表明，饲料桑的初始产气速度较快，而牛用全价精料初始阶段可能因发酵不完全，产气量相对较少，之后产气速度加快，超过一定时间后产气速度又逐渐下降，到24 h时，产气速度趋于平稳。本试验中，饲料桑在发酵时间点2 h、4 h、12 h时产气量均显著高于牛用复合精料的产气量，其在12 h、24 h的累计产气量也均显著高于牛用全价精料产气量，有研究表明[10]非纤维性碳水化合物含量与发酵速度呈正相关的结论，有可能是饲料桑中的非纤维性碳水化合物含量比牛用全价精料中的要高。本研究中饲料桑叶比牛用全价精料的产气量显著提高，说明饲料桑更易于发酵，与张桂杰[12]等研究的不同发育期的豆科牧草有相似的产气性能，从这个角度讲，饲料桑的饲用价值比牛用全价精料要高。

pH是反映瘤胃稳定性的重要指标。日粮的结构是影响 pH 的主要因素，过高或过低对瘤胃微生物的生长、发育和发酵都会产生影响[13]，正常瘤胃液pH范围5.5～7.5。pH 越低，说明发酵所产的酸累积得越多。本试验中,饲料桑发酵液的pH在12 h、24 h时为5.55±0.01，5.41±0.01，接近正常瘤胃液pH值范围5.5～7.5，显著高于牛用全价精的4.78±0.02，4.63±0.01，可见，饲料桑对瘤胃液pH值影响要比牛用全价精料小很多。

体外干物质消化率反映了评价饲料消化的难易程度[14]，与饲料中NDF和ADF的含量有关。文亦芾[15-16]等的研究结果表明体外干物质消化率与NDF和ADF的含量呈极显著负相关。靳玲品[17]的研究则表明，干物质消化率与粗蛋白质含量呈负相关。本试验中饲料桑叶和牛用全价精料的消化率都很高，在发酵12 h和24 h后分别为54.08%、61.93%和56.30%、62.97%。饲料桑叶的干物质消化率在发酵12 h和24 h时均显著低于牛用全价精料的消化率，应该是与饲料桑中较高的粗纤维和粗蛋白含量相关。

Owens[18]等认为，瘤胃微生物菌体蛋白合成水平受氨态氮含量的限制，且需要VFA提供能量，在一定范围内，瘤胃内的能氮比例合适时，微生物菌体蛋白的合成效率最大。本试验中，饲料桑的菌体蛋白在12 h、24 h时均高于牛用全价精料，在12 h时两者差异显著，表明添加饲料桑的发酵液中微生物活性比添加牛用全价精料大，即饲喂饲料桑后，瘤胃微生物合成菌体蛋白的能力高于饲喂牛用全价精料。氨态氮浓度也是评价瘤胃内环境的重要指标[19]，其反映了蛋白质合成与降解所达到的平衡状况[20]。本试验在发酵12 h时，饲料桑和牛用全价精料的NH3-N浓度分别为11.54 mg/dl，3.88 mg/dl；24 h时，分别为16.16 mg/dl和6.57 mg/dl，在12 h和24 h时，饲料桑的NH3-N浓度均显著高于牛用全价精料的NH3-N浓度。

VFA的总产量等可显著影响反刍动物对营养物质的吸收与利用，是反刍动物主要的能量来源[21]。本试验中，产气量较高的饲料桑粉的总挥发性脂肪酸浓度在12 h却比牛用全价精料低，在24 h时则显著低于牛用全精料的总挥发性脂肪酸浓度， 这与张元庆[22]等的研究结果不一致；也有研究表明乙酸/丙酸值的大小与能量利用效率成线性相关[23]，本试验中发酵到12 h时，饲料桑的该比值略低于牛用全价精料比值；但在24 h时，饲料桑的该比值略高于牛用全价精料比值，但都无显著差异，说明二者能量利用效率无差异。

4 结论

与牛用全价精料相比，饲料桑叶具有较高的粗蛋白质和粗脂肪含量、相对容易发酵且发酵过程中微生物蛋白质合成率高，pH和氨态氮水平也更符合反刍动物瘤胃内环境。综上可以初步得出结论：饲料桑叶具有较高的营养价值，可以作为反刍动物的精饲料用于日粮中，但其最适添加比例有待进一步研究探讨。