子宫内膜缺血预处理在EMs细胞凋亡中的抑制作用

王 维，孙 玲，陈丽琼，孙 燕，高 峰

(巴中市中医院妇产科，四川 巴中 636000)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是一种临床常见的妇科病，是雌激素依赖的妇科良性疾病之一，其主要临床症状表现在不孕、慢性盆腔痛、痛经、性交痛等，甚至可诱发恶性肿瘤，对女性身心健康造成极大的影响[1]。目前，有关EMs的具体发病机制仍未完全定论，但血管生成是该病发生和发展的主要环节，而血管内皮生长因子是参与血管生成的主要调节因子[2]。既往研究报道，血管内皮生长因子在缺血缺氧模型组织中的表达水平明显升高[3-4]。EMs患者在月经前期或早、中期可出现子宫收缩，而子宫收缩可使子宫内膜发生短暂性缺血或处在低灌注状态，使得局部组织发生短暂性缺血、缺氧，而短暂性缺血、缺氧可影响细胞生存，使子宫内膜增厚，进而导致病变。出于伦理学等方面的考虑，目前是通过建立动物模型展开EMs的研究，特别是相关机制的研究，该类模型类型多样，但“腹腔注射内膜法”是目前较为符合“经血逆流内膜种植”学说的方法[5]，然而目前仍未完全明确“腹腔注射内膜法”构建的子宫内膜缺血模型在EMs中的作用及其可能机制。为此，本研究旨在通过构建子宫内膜缺血预处理和缺血小鼠模型，研究子宫内膜缺血预处理对EMs模型小鼠异位内膜细胞的凋亡抑制作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

2018年9月至2019年6月于巴中市中医院动物实验室展开研究，选择SPF级C57BL/6雌性小鼠，8～10周龄，体重20～28g，性周期3～5周，由南京君科生物工程有限公司提供，于实验室进行常规饲养，及时给予饲料和水分。

1.2方法

1.2.1动物模型的构建

以动情期雌性小鼠(经阴道涂片检测)为供体鼠，肌肉注射卡前列素氨丁三醇注射液(国药准字H20094183)0.5mg/kg进行缺血预处理，或给予生理盐水0.1mL，每日1次，共3天；4天后，用5%水合氯醛0.01mL/g经腹腔麻醉，麻醉成功后通过开腹结扎子宫动脉宫端支和卵巢端进行缺血处理，2h后将小鼠处死(用颈椎脱臼法)，之后收集子宫内膜并切成大小一致8片(1mm×1mm)。以动情期雌性小鼠(经阴道涂片检测)为受体鼠，将供体鼠预处理完毕后第4天采集的内膜组织注射至受体鼠腹腔内，每只小鼠腹腔内注入8片内膜，记录小鼠造模成功率。

1.2.2实验分组

按照处理方式的不同，将80只受体鼠分为A组(未处理，作为对照)、B组(缺血预处理)、C组(缺血处理)、D组(缺血预处理+缺血处理)、E组(给予Akt抑制剂处理的缺血预处理+缺血处理)，每组各16只。将60只供体雌性小鼠随机分为五组，每组各12只。在受体鼠中，A组不作缺血预处理，第4天后腹腔内不作缺血处理；B组作缺血预处理，第4天后腹腔内未进行缺血处理；C组不作缺血预处理，第4天时开腹进行缺血处理，处理方法与供体鼠相同；D组作缺血预处理，第4天时开腹进行缺血处理；E组肌肉注射卡前列素氨丁三醇注射液前10～15min，静脉注射Akt抑制剂(LY294002)10μmol/kg，其余处理方法与D组相同。

1.2.3移植内膜存活的测定

留取各供体鼠造模前部分内膜组织为造模前对照组织，根据颈椎脱臼法于造模后第7天将受体鼠处死，观察受体鼠腹腔移植内膜形态状况，并对其存活率进行计算。剖腹探查，观察小鼠异位子宫内膜生长状况，经HE染色证实造模是否成功，并根据改良的Ishak组织学评分判定病灶是否存活。

1.2.4移植内膜组织形态的观察

收集受体鼠腹腔移植内膜组织标本，采用4%多聚甲醛固定1天，之后进行常规石蜡切片，切片厚度为3μm，对切片组织进行二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水，之后进行HE染色，于光学显微镜下对受体鼠移植内膜组织形态进行观察。

1.2.5细胞凋亡的检测

收集造模前和造模后第7天小鼠腹腔移植内膜，严格根据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(购自德国罗氏公司)说明书指示进行细胞凋亡的检测。将标本切片置于高倍光镜下进行观察，随机选取10个视野，根据棕黄色为凋亡细胞、蓝色为正常细胞，对细胞凋亡数进行计算。

1.2.6 Bax、Bcl-2及Akt蛋白表达的检测

分别取各组受体鼠移植内膜组织100mg，加入细胞裂解液100μL和苯甲基磺酰氟10μL进行匀浆，之后将所得液体置于冰上裂解30min；于4℃下，采用高速离心机以10 000r/min离心15min，弃其上清，将蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过灰度值扫描检测各组受体鼠移植内膜组织中Bax、Bcl-2及Akt蛋白水平，并与-actin进行比较后得到灰度值比。

1.2.7 Bax mRNA、Bcl-2 mRNA及Akt mRNA的检测

实时荧光定量PCR仪购自罗氏诊断公司(型号为z480)。Bax、Bcl-2及Akt单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)对造模前内膜组织和受体鼠造模后移植内膜组织总RNA进行提取，之后进行逆转录，采用PCR扩增仪(购自美国ABI公司，型号为2720型)对Bax、Bcl-2及Akt基因进行PCR扩增，以扩增-actin为内参物。将5μL Buffer、3μL RT引物及100ng总RNA加入逆转录反应体系(逆转录酶1μL，0.5μL RNase抑制剂，无RNA酶无菌双蒸水15μL)中，取逆转录产物上、下游引物，加无菌双蒸水至25μL。于95℃下进行预变性3min，以相同温度变性30s，50℃退火30s，72℃进行延伸30s，共进行30个循环；72℃延伸3min。实验重复3次后取其均值为最终所测值。

1.3统计学方法

2结果

2.1各组受体鼠移植内膜组织形态观察结果

于造模后第7天经肉眼观察可见各组受体鼠均出现病灶；经剖腹探查，可见病灶形成，HR染色镜下观察可见血管形成，见图1。

五组小鼠造模成功率及移植内膜存活率的比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；B组小鼠造模成功率和移植内膜存活率较A组均明显上升(均P<0.05)，C组小鼠造模成功率和内膜存活率较B组均明显下降(均P<0.05)，D组小鼠造模成功率和内膜存活率较C组均明显上升(均P<0.05)，E组小鼠造模成功率和内膜存活率与D组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

注：每幅左下角小图为HE染色(×200)。

图1 各组受体鼠移植内膜组织形态观察结果
Fig.1 Histological observation of transplanted endometria of recipient mice in each group

表1 各组小鼠造模成功率及移植内膜存活率的比较结果[n(%)]Table 1 Comparison of success rate and survival rate of transplantedendometria in mice of each group[n(%)]

注：a与A组比较，P<0.05；b与B组比较，P<0.05；c与C组比较，P<0.05；*每只小鼠腹腔内注入8片内膜。

2.2各组小鼠移植内膜细胞凋亡率的比较

五组小鼠移植内膜细胞凋亡率比较差异具有统计学意义(F=54.95，P<0.05)。B组移植内膜细胞凋亡率为(14.93±3.66)%，A组为(15.97±3.05)%，两组比较差异无统计学意义(t=0.87，P>0.05)；C组移植内膜细胞凋亡率为(84.06±9.36)%，明显高于B组(t=27.51，P<0.05)；D组移植内膜细胞凋亡率为(58.08±8.25)%，明显低于C组(t=8.33，P<0.05)；E组移植内膜细胞凋亡率为(84.13±7.86)%，明显高于D组(t=9.14，P<0.05)。

2.3各组小鼠Bax、Bcl-2及Akt蛋白表达水平的比较

五组小鼠Bax、Bcl-2及Akt蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。经Western blot法检测结果发现，B组Bax、Bcl-2和Akt蛋白表达水平较A组均显著上升(均P<0.05)；C组Bcl-2和Akt蛋白表达水平较B组均显著下降(均P<0.05)；D组Bax蛋白表达水平较C组显著下降，而Bcl-2和Akt蛋白表达水平较C组均显著上升(均P<0.05)；E组Bax蛋白表达水平较D组显著上升，而Bcl-2和Akt蛋白表达水平较D组均显著下降(均P<0.05)，见表2。

2.4各组小鼠Bax mRNA、Bcl-2 mRNA及Akt mRNA相对表达量的比较

五组小鼠Bax mRNA、Bcl-2 mRNA及Akt mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。经实时荧光定量PCR检测结果发现，B组Bax mRNA、Bcl-2 mRNA及Akt mRNA相对表达量较A组均明显上升(均P<0.05)；C组Bax mRNA相对表达量较B组明显上升，而Bcl-2 mRNA和Akt mRNA相对表达量较B组均显著下降(均P<0.05)；D组Bcl-2 mRNA相对表达量较C组显著上升(P<0.05)；E组Bax mRNA相对表达量较D组显著上升，而Bcl-2 mRNA和Akt mRNA相对表达量较D组均显著下降(均P<0.05)，见表3。

表2 各组小鼠Bax、Bcl-2和Akt灰度值比的比较结果Table 2 Comparisons of Bax，Bcl-2 and Akt gray scale ratios of mice in each

注：a与A组比较，P<0.05；b与B组比较，P<0.05；c与C组比较，P<0.05；d与D组比较，P<0.05。

表3 各组小鼠Bax mRNA、Bcl-2 mRNA和Akt mRNA相对表达量的比较结果Table 3 Comparison of relative expression of Bax，Bcl-2 and Akt in mice of each

注：a与A组比较，P<0.05；b与B组比较，P<0.05；c与C组比较，P<0.05；d与D组比较，P<0.05。

3讨论

3.1 PI3K/Akt信号通路对EMs研究的作用

目前，存在多种有关EMs的学说，其中“经血逆流内膜种植学说”可较好地解释这一临床现象，但此学说未能说明“为何超出90%的女性发生经血逆流，仅有15%的妇女发生EMs”这一状况[6-7]。EMs除了受p53、白介素-8及肿瘤坏死因子-等多种凋亡及抗凋亡蛋白影响外，Akt等多种信号转导通路亦参与其病理过程[8-9]。有研究表明，PI3K/Akt信号通路与血管新生存在显著关系[10]。另有研究认为，PI3K/Akt信号通路与EMs的发生及发展密切相关，并且在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶协同作用下，PI3K蛋白可通过结合Akt诱导其Thr308位点或Ser73位点发生磷酸化，继而促使该通路激活并诱导下游蛋白或靶向因子的表达[11-12]。这也是本研究以PI3K/Akt信号通路为研究对象的原因所在。

3.2 PI3K/Akt信号通路与本研究缺血预处理两者间的关系

有研究表明，常规缺血预处理具有诱导血管内皮生长因子表达的作用[13]。本研究发现，B组小鼠造模成功率较A组明显升高，D组造模成功率和内膜存活率较C组均明显升高。此外，本研究显示，B组移植内膜细胞凋亡数与A组比较并无显著性差异，其原因有待今后进一步解释；D组移植内膜细胞凋亡数较B组明显升高，但较C组明显下降，提示缺血预处理可提高组织对严重缺血缺氧的耐受能力，分析其原因，可能缺血预处理可激活血管新生通路，进而发挥阻滞细胞凋亡的作用。本研究表明，采取“腹腔注射内膜法”具有较高的造模成功率，但C组造模成功率相对较低的原因可能是在对子宫动脉宫端支和卵巢端进行结扎时，因缺血使得血供减少，导致供体鼠体内内膜坏死，所以将内膜组织经腹腔注射至受体鼠后的存活率较低引起。

PI3K/Akt信号通路与促进细胞存活和阻滞细胞凋亡密切相关，而Bax和Bcl-2等均是其下游重要信号分子[14]。有研究显示，Bcl-2/Bax比例降低而诱导细胞凋亡，而Bcl-2/Bax比例上升可阻滞细胞凋亡[15-16]。本研究表明，经缺血预处理可诱导Bax和Bcl-2蛋白表达改变，并且采用“腹腔注射内膜法”产生的EMs病灶可能是通过激活Akt磷酸化，进而促使其下游靶蛋白Bax和Bcl-2活化，最终起到阻滞细胞凋亡的作用。同时，本研究经实时荧光定量PCR检测结果表明，经缺血预处理可能起到诱导血管新生和阻滞细胞凋亡的效果；而Akt抑制剂(LY294002)可阻滞PI3K和Akt蛋白磷酸化，因此可阻滞血管新生通路，提示缺血预处理效果可能是经PI3K/Akt信号通路而实现。

综上所述，子宫内膜缺血预处理可起到有效阻滞EMs异位移植内膜细胞凋亡的作用，且这一抑制作用机制可能与Akt信号通路磷酸化及影响Bax、Bcl-2等下游靶蛋白表达密切相关。