食管鳞癌中TROP2与EMT的表达及相关性研究

雷海鸣 李 剑 周鉴基

1.江苏医药职业学院临床医学院，江苏盐城 224005；2.江苏省盐城市第二人民医院外科，江苏盐城 224003

食管癌是全球一种常见的恶性消化道肿瘤，我国是食管癌的高发地区，在国内恶性肿瘤中其发病率排第四位，全球约60% 的食管癌发生在我国[1]。鳞状细胞癌和腺癌是食管癌的主要组织学类型，大约90%为鳞状细胞癌[2]。其早期临床症状不典型，诊断比较困难，虽然外科手术和放化疗等治疗方法在不断发展，但预后仍然较差，5 年生存率仍然相对较低，其主要原因与肿瘤的浸润、转移和复发等因素有关。

人滋养层细胞表面抗原2（trophoblastic cell surface antigen 2，TROP2）是一种单跨膜表面糖蛋白，也称为膜组分表面标志物-1 和肿瘤相关钙信号转导物-2，是TACSTD2 基因的蛋白质产物，参与细胞内钙离子浓度的调节[3]。TROP2 首次被发现于人类滋养层细胞中，是侵袭人类滋养层细胞的生物学标记，并发现其与细胞周期蛋白D1 和蛋白激酶C（PKC）水平的调节有关，后者激活有丝分裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ ERK）途径可以增加细胞周期蛋白D1 和细胞周期蛋白E 的表达[4]。通过调节细胞生长、迁移和自我更新，Trop2 在发育和肿瘤发生中具有多方面的作用[5]。TROP2 是一种致癌基因，与多种类型的恶性肿瘤的发生、发展和转移密切相关[6-10]。 此外，在某些消化道癌症中，升高的TROP2 表达与淋巴结转移、肿瘤分化和其他临床病理特征显著相关[11-12]。上皮-间质转化(EMT)是指上皮细胞在生理或病理情况下向间质细胞的转变，研究发现，EMT 不仅在人类胚胎的发育过程中起作用, 也是导致肿瘤侵袭、转移的一个重要机制[13-14]。

本研究通过检测TROP2 和EMT 标记物在食管鳞癌组织中的表达，以及癌旁正常组织TROP2的表达，分析并探讨TROP2 与食管鳞癌侵袭、转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年1 月～2019 年10 月江苏省盐城市第二人民医院行手术治疗的50 例食管癌患者的癌组织、癌旁正常组织（距离癌灶边缘＞5cm，病理证实未发现肿瘤细胞）。所有患者在术前未发现明显手术禁忌证，均未进行放射、化学和靶向等治疗，术后病理检查均为鳞状细胞癌。男39 例，女11 例，年龄42 ～75 岁，平均61.1 岁。根据第8 版AJCC食管癌TNM 分期：Ⅱ期32 例，Ⅲ～Ⅳ期18 例。浸润深度：T1 ～T2 40 例，T3 ～T4 10 例。组织分化程度：高分化3 例，中分化35 例，低分化11 例，未分化1 例。淋巴结转移：发现淋巴结转移13 例，未发现淋巴结转移者37 例。见表1。

1.2 纳入标准

（1）所有患者术前和术后病理组织检查均已确诊；（2）无严重心脏及肝脏疾病、凝血功能障碍；（3）术前均未进行放射、化学和靶向等治疗。

1.3 方法与主要试剂

用免疫组织化学法检测TROP2 及EMT 相关标记物的表达，兔多克隆抗TROP2 抗体、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 抗体购自（美国Santa Cruz公司），山羊抗兔二抗（凯基生物科技有限公司）。采用SP 法，10%甲醛固定标本后石蜡包埋，行连续切片，每张组织切片4μm，烤片2h，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，0.01mol/L 枸橼酸钠缓冲液抗原热修复，3%H2O2孵育以阻断内源性过氧化物酶，加一抗（稀释比例TROP2 为1 ∶100，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin 为1 ∶200），4℃孵育过夜，PBS 清洗3次，每次5min，二抗在37℃下孵育30min，PBS 清洗3 次，每次5min，DAB 室温显色，蒸馏水冲洗终止显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在显微镜下观测并拍照。

1.4 结果判断

镜下观察，每张切片选取5 个高倍视野（×400），按细胞是否着色分为阳性和阴性，TROP2、E-cadherin 和N-cadherin 的阳性着色均位于细胞膜和细胞质，Vimentin 阳性着色位于细胞质（图1），均呈棕黄色颗粒，根据阳性细胞所占的比例进行评分，＜20%为阴性，≥20%为阳性。

图1 食管鳞癌组织中TROP2、N-cadherin，vimentin 和E-cadherin 的表达（×400）A.TROP2；B.N-cadherin；C.Vimentin；D.E-cadherin

1.5 统计学处理

应用SPSS20.0 统计软件进行统计分析，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TROP2在食管鳞癌与癌旁正常组织中的表达

50 例食管鳞癌组织中TROP2 的阳性表达率为62.0%（31/50），癌旁正常组织的阳性表达率为19.0%（8/42），差异有统计学意义（χ2=22.236，P ＜0.001）。

2.2 TROP2的表达与临床病理资料间的关系

TROP2 在不同性别、年龄、浸润深度、组织学分级、淋巴结转移及临床分期中的表达情况见表1。TROP2 的表达与患者的性别（χ2=0.160，P=0.899）、年 龄（χ2=0.536，P=0.464）无 关，与 组 织 学 分级（χ2=5.898，P=0.015）、浸 润 深 度（χ2=4.160，P=0.041）、临床分期（χ2=8.631，P=0.003）及淋巴结转移（χ2=7.273，P=0.007）有关。

表1 TROP2的表达与食管鳞癌患者临床病理特征之间的关系

2.3 食管鳞癌中TROP2的表达与EMT相关标记物表达的相关性

TROP2、N-cadherin、Vimentin 和 E-cadherin在食管鳞癌组织中的阳性表达率分别为62.0%、54.0%、56.0%、40.0%。分析显示，食管鳞癌组织中TROP2 的表达与N-cadherin 表达呈正相关（r=0.352，P=0.012)，与Vimentin 表达也呈正相关（r=0.468，P=0.001)，而与E-cadherin 表达呈负相关（r=-0.454，P=0.001)。见表2。

3 讨论

食管鳞癌是食管癌的最主要类型，其特点是侵袭性高、预后较差，发生发展与多种因素密切相关，侵袭和转移是影响预后的重要因素。寻找可靠的预后相关分子标志物，对于食管鳞癌的预后判断、提高疗效具有重要的临床指导意义。

滋养层细胞表面抗原2（TROP2）由323 个氨基酸组成，在内质网中合成，运输到高尔基体中被糖基化，是一种钙信号转导因子，作为肿瘤驱动因子可驱动恶性肿瘤生长[15]，在恶性肿瘤进展中起重要作用[16]。TROP2 的表达和（或）活性改变与癌细胞的生长、增殖、迁移、侵袭和存活有关，是恶性肿瘤患者预后的潜在标志[17]。本研究结果显示，TROP2 在食管鳞癌组织中的表达高于癌旁正常组织（P ＜0.05），提示TROP2 可作为食管鳞癌诊断的分子标志物。其表达与患者的性别、年龄无明显相关（P ＞0.05），与组织学分级、淋巴结转移、浸润深度及TNM 临床分期有相关性（P ＜0.05），提示TROP2 对食管鳞癌的侵袭、转移可能具有促进作用。

上皮-间质转化（EMT）被认为在癌症的侵袭和转移过程中具有重要作用[18]，在此过程中，上皮细胞失去其特性，并获得间质表型，EMT 促进肿瘤细胞迁移和侵袭，导致免疫抑制，并阻止细胞凋亡和衰老[19]。N-cadherin 的表达上调及E-cadherin的表达下调是EMT 的主要表现[20]。Trop2 通过诱导乳腺癌中EMT 过程促进了乳腺癌细胞的迁移和侵袭，导致淋巴结受累和远处转移[21]。胆囊癌中，TROP2 可通过调节PI3K/AKT 途径诱导EMT 来促进胆囊癌细胞的增殖、迁移和转移[22]。通过对食管鳞癌组织中TROP2 与EMT 相关标记物的相关性分析，提示TROP2 可能通过调控EMT 标记物的表达而促进EMT 的发生，在食管鳞癌侵袭和转移中发挥重要作用。

总之，在食管鳞癌组织中TROP2 高表达，可能与食管鳞癌的进展密切相关，TROP2 可以作为食管鳞癌的潜在治疗靶标。多种细胞因子、信号通路等因素可调控EMT 的发生，TROP2 可能具有诱导食管鳞癌中EMT 过程的作用，但其具体作用机制尚不清楚，有待后期进一步的研究。