广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌耐药性及其整合子—基因盒检测

贺晓晨，韩书煜，黎姗梅，胡大胜，黄德生，吴伟锋，黄 钧，梁静真*，胡庭俊*

(1.广西大学动物科学技术学院/广西水生动物病害诊断实验室，广西 南宁 530004；2.广西水产技术推广总站，广西 南宁 530022；3.合浦县水产技术推广站，广西 北海 536100)

【研究意义】凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)又名南美白对虾，具有肉嫩味美、营养丰富、适盐范围广、生长迅速和抗病能力强等优点，是全球主要对虾养殖品种之一。但凡纳滨对虾弧菌性疾病在其养殖业迅猛发展的同时常暴发流行，导致养殖经济损失巨大，严重制约凡纳滨对虾产业的可持续发展。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种广泛分布于海水或内陆咸水的嗜温嗜盐革兰氏阴性杆菌[1]，属于鱼、虾和贝等水生动物的条件性致病菌[2]，可引起对虾红体、烂鳃及早期死亡综合征等疾病，甚至造成对虾大量死亡[3]。在生产中，由于养殖户使用抗生素的方式方法不科学及养虾塘受含有抗生素畜禽养殖废水的污染，部分养虾塘中的弧菌已产生耐药性，严重威胁对虾食用质量安全。因此，检测分析凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性及相关耐药基因，对指导弧菌病防控和揭示其耐药机制具有重要意义。【前人研究进展】Bakeraustin等[4]、Lopatek等[5]、Fattel等[6]分别对美洲、欧洲和亚洲的海水环境或水生动物源副溶血弧菌进行了耐药性检测。国内众多学者也对我国20多个省(区)各种来源的副溶血弧菌进行了耐药性调查[3，7-10]。以上研究结果表明，不同地区的副溶血弧菌耐药性存在明显差异，且部分菌株存在多重耐药现象。细菌产生多重耐药的主要原因是细其可通过某些途径获得外源耐药基因[11]。整合子(根据整合酶不同可分为I、II和III型整合子)是一个能捕获、整合、表达外源耐药基因的位点特异性重组系统，能随可移动遗传组件(质粒和转座子等)在细菌种内或种间进行水平转移[12]。在细菌中以I型整合子最常见[13]，其结构通常包含5′端保守区(5′-CS)、3′端保守区(3′-CS)及二者间的可变区，其中，5′-CS含有整合酶基因int1，大部分I型整合子的3′-CS含有季铵盐耐药基因qacEΔ1和磺胺类耐药基因sul1，可变区通常可整合β-内酰胺类耐药基因bla、氨基糖苷类耐药基因aac和aad等各种耐药基因盒[14]。国内外大量研究表明，不同来源弧菌的整合子携带率不同，其基因盒的携带情况也存在地域差异[14-19]。【本研究切入点】迄今，关于水产养殖源副溶血弧菌整合子分布的研究主要集中在我国海南和华东地区及秘鲁和韩国等地区的分离株上[14-19]，针对广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌中整合子—基因盒的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以K-B纸片扩散法检测2013-2018年104株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性，采用PCR检测分离株的整合子—基因盒携带情况，并分析整合子—基因盒与弧菌耐药表型的相关性，为凡纳滨对虾副溶血弧菌病防控及该菌耐药分子机制的深入研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

104株受试副溶血弧菌由广西水生动物病害诊断实验室于2013-2018年分离自广西养殖发病的凡纳滨对虾，所有菌株均已进行API生化鉴定和16S rRNA分子鉴定。其中，36株分离自广西北海市，命名为BH01～BH36；35株分离自广西钦州市，命名为QZ01～QZ35；33株分离自广西防城港市，命名为FCG01～FCG33。

1.2 主要试剂

PCR扩增引物参考姚小娟[14]的方法进行设计(表1)，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

表1 整合子—基因盒PCR扩增的引物序列、退火温度及产物长度

注：CS 为保守区。

Note:CS is indicated as conserved segment.

2×TaqMasterMix和细菌基因组DNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。克隆载体pMD18-T和大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞购自宝日医生物技术(北京)有限公司。琼脂糖购自美国Invi-trogen公司。

试验用药敏纸片共16种，其中，新霉素(NEO，30 μg/片)、复方新诺明(SXT，磺胺甲恶唑/甲氧苄啶，23.75/1.25 μg/片)、诺氟沙星(NOR，10 μg/片)、环丙沙星(CLX，5 μg/片)、氧氟沙星(OFX，5 μg/片)、左氧氟沙星(LVX，5 μg/片)、恩诺沙星(ENR，5 μg/片)、多西环素(DOX，30 μg/片)和头孢拉定(RAD，30 μg/片)等9种购自杭州天和微生物试剂有限公司，其余7种参考刘杰[20]的方法自制，分别为氟苯尼考(FFC，30 μg/片)、甲砜霉素(TAP，30 μg/片)、盐酸沙拉沙星(SAR，5 μg/片)、磺胺二甲嘧啶(SM2，25 μg/片)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM，25 μg/片)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD，25 μg/片)和复方磺胺嘧啶(SD，25 μg/片)。所有药敏纸片均置于4 ℃冷藏备用。

1.3 试验方法

1.3.1 药敏试验 采用K-B纸片扩散法测定104株凡纳滨对虾源副溶血弧菌对16种抗菌药物的敏感性，试验结果根据美国临床实验室标准协会(CLSI)判定标准进行判定。

1.3.2 整合子—基因盒PCR检测 按试剂盒说明提取细菌总DNA，并进行PCR扩增。PCR反应体系25.0 μl：2×TaqMasterMix 12.5 μl，上、下游引物各1.0 μl，DNA模板1.0 μl，ddH2O 9.5 μl。扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。采用1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。将回收纯化后的PCR扩增产物与克隆载体pMD18-T连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将阳性克隆送至深圳华大基因科技有限公司测序。

1.4 统计分析

采用SPSS 20.0对不同地区整合子—基因盒检出率的差异性及整合子—基因盒与耐药表型的相关性进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的药敏试验结果

从图1可看出，凡纳滨对虾源副溶血弧菌对FFC、LVX、OFX和NOR的敏感性较高，敏感率分别为82.7 %、79.8 %、73.1 %和71.2 %；对SMM、SM2、SD和SMD表现出较强的耐药性，耐药率分别为100.0 %、99.0 %、93.3 %和83.7 %；对其他抗菌药物的敏感率在7.7 %～63.5 %。说明104株凡纳滨对虾源副溶血弧菌对16种抗菌药物表现出不同程度的敏感性，其中对FFC、LVX、OFX和NOR较敏感，对SMM、SM2、SD和SMD较耐药。

图1 广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对16种抗菌药物的敏感性Fig.1 Susceptibility of V. parahaemolyticus isolated from L. vannamei in Guangxi towards 16 kinds of antibiotics

2.2 广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的多重耐药情况及耐药谱

从图2可看出，2013年的分离株主要为二重～五重耐药，无八重及以上耐药菌株，2014年以后，每年五重以上耐药菌株所占比例均超过90.0 %，至2018年，新增九重耐药菌株，八重和九重耐药菌株数量合计占当年菌株总数的55.6 %。说明2013-2018年广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌多重耐药状况有明显加重趋势。

由表2可知，104株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药谱共20种，耐药谱型丰富度为19.2 %。其中，优势耐药谱为SD/SM2/SMM/SMD/SXT/RAD，共17株，占菌株总数的16.3 %；二重耐药株3株，占2.9 %；三重耐药株8株，占7.7 %；四重耐药株6株，占5.8 %；五重耐药株33株，占31.7 %；六重耐药株21株，占20.2 %；七重耐药株14株，占总数的13.5 %；八重耐药株16株，占15.4 %；九重耐药株3株，占2.9 %。说明广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌具有一定的耐药谱型丰富性。

各年菌株数分别为：2013-2015、2017和2018年均为18株，2016年为14株 The strain amounts in each year are as follows：18 isolates in the year 2013-2015，2017 and 2018，14 isolates in the year 2016图2 广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的多重耐药状况Fig.2 Multidrug resistance status of V. parahaemolyticus isolated from L. vannamei in Guangxi

2.3 整合子—基因盒的检出情况

经PCR检测发现，104株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株中int1基因阳性菌株有67株，检出率为64.4 %；经反复PCR检测，所有菌株均未检出int2和int3基因；sul1基因和qacEΔ1基因阳性菌株数分别有26和29株，检出率分别为25.0 %和27.9 %；int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的菌株有23株，即典型的I型整合子总检出率为22.1 %。部分菌株int1、sul1和qacEΔ1基因的PCR扩增电泳结果见图3。

表2 广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株的耐药谱

M：DL1000/2000 DNA Marker；N：阴性对照；1～9：被检菌株M：DL1000/2000 DNA Marker；N：Negative control；1-9：Strains detected图3 广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株的整合子—基因盒PCR扩增电泳结果Fig.3 PCR amplification results of integron-gene cassettes of V. parahaemolyticus strains isolated from L. vannamei in Guangxi

对int1、sul1和qacEΔ1基因(I型整合子保守区)均为阳性的23株菌株进行I型整合子可变区PCR扩增，结果表明，在菌株BH15、BH18、BH25、FCG05、FCG18和QZ17中可检测到片段长度约1300 bp的I型整合子可变区片段(图3)，检出率为26.1 %。对该6株菌株可变区片段进行克隆和测序，将测序结果与GenBank中的对应序列进行比对分析，检出blaCTX-M-2-aadA1(BH15、BH18、QZ17、FCG18)和blaVIM-60-aadA1-aacA(FCG05、BH25)2种基因盒。

由表3可知，凡纳滨对虾源副溶血弧菌int1基因在广西北海市、钦州市和防城港市分离株中的检出率依次为36.1 %、68.6 %和90.9 %，三者间差异显著(P<0.05，下同)；qacEΔ1基因在广西北海市、钦州市和防城港市分离株中的检出率依次为33.3 %、42.9 %和6.1 %，三者间差异极显著(P<0.01)；sul1基因和I型整合子可变区在这3个市分离株中的检出率无显著差异(P>0.05，下同)。说明I型整合子—基因盒在广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株中的流行程度具有一定差异性。

2.4 I型整合子及基因盒与菌株耐药性的相关性分析

由表4可知，int1阳性广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株对TAP的耐药率显著高于int1阴性菌株；由于未检测到相应的敏感、中介或耐药菌株，凡纳滨对虾源副溶血弧菌对SMM、ENR、LVX、FFC的耐药表型与int1基因的相关性无法计算；副溶血弧菌对其余抗菌药物的耐药表型与int1基因无显著相关性。说明广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株对大部分抗菌药物的耐药表型与I型整合子无明显的相关性。

表3 广西3个市凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株的整合子—基因盒检出率比较

注：括号里的数字为携带相应基因的菌株数与受试菌株总数之比；*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Figures in the brackets indicate the amounts of strains harboring the relevant genes versus the total amounts of strains detected；* represented significant difference(P<0.05)，**represented extremely significant difference(P<0.01).

表4 int1阳性和int1阴性广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株的耐药性比较

注：-表示无法计算，下同；*表示差异显著(P<0.05)。

Note:- indicates that the value could not be calculated，the same as below. * indicates significant difference (P<0.05).

表5 整合子相关基因阳性菌株和阴性菌株的耐药性比较

在I型整合子可变区检出基因盒的6株分离株(BH15、BH18、QZ17、FCG18、FCG05和BH25)均为五重或五重以上耐药菌株(表2)。由表5可知，在int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的23株广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌中，RAD的耐药表型与基因盒blaCTX-M-2和blaVIM-60、5种磺胺类抗菌药物的耐药表型与sul1基因间的相关性均不显著，NEO的耐药表型与基因盒aadA1和aacA的相关性无法计算。说明在广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌菌株中各基因盒与相应抗菌药物耐药表型也无明显的相关性。

3 讨 论

3.1 广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌的耐药性

抗菌药物不规范使用导致水产养殖源弧菌多重耐药性日益加重[5，18]。2013-2018年，广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌多重耐药状况有明显加重趋势，八重及八重以上耐药菌株所占比例由2013年的无攀升到2018年的55.6 %。据调查显示，广西凡纳滨对虾养殖户在养虾过程中极少购买或使用抗生素，推测副溶血弧菌多重耐药性的加重可能与养殖水体受医院、生活或畜禽养殖污水中的抗生素污染或耐药基因的传播有关[3，21]。本研究中，受试菌株对大部分磺胺类的耐药率均较高，与天津和浙江等地分离株的药敏试验结果相似[22-23]。磺胺类药物是一种价格低廉的人兽共用药，已广泛用于临床治疗和畜禽养殖等，但长期不规范使用促使其频繁渗入环境。目前，我国地表水环境中磺胺类药物总体浓度远高于其他国家[24]，推测本研究分离株对磺胺类的耐药性主要受到扩散至环境中的磺胺类所诱导。本研究结果表明，广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对氟苯尼考敏感率(82.7 %)最高，但低于刘杰等[7](95.81 %)和黄伟德等[3](96.7 %)的检测结果，可能与2017-2018年采集的菌株对氟苯尼考中介率相对较高有关，需给予高度重视并进一步调查具体原因。建议在对虾养殖过程中：①尽可能不使用抗菌药物进行疾病防控；②当弧菌病暴发必须使用抗菌药物时，应根据药敏结果选择敏感抗菌药物治疗；③要避免低浓度或长期使用同种药物，因为低浓度、长期使用同种药物会诱导细菌产生耐药性[25]；④根据本研究的药敏试验结果，尽管氟苯尼考敏感率有所下降，其仍可考虑作为广西凡纳滨对虾副溶血弧菌病防治的备选药物。

3.2 广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌整合子—基因盒携带情况

本研究结果表明，I型整合子在广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌中具有一定的流行性，I型整合酶基因int1检出率为64.4 %，低于Dahanayake等[19](90 %)、姚小娟[14](89.62 %)的检出率，但高于刘旭[16](5.6 %)、李林桂[15](2.8 %)和Sulca[18](0)等的检出率；I型整合子3′-CS的sul1基因和qacEΔ1基因检出率分别为25.0 %和27.9 %，均高于其他研究报道的水产养殖源弧菌检出率[14-16]；I型整合子可变区的基因盒包括β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M-2和blaVIM-60及氨基糖苷类耐药基因aadA1和aacA。其他水产养殖源弧菌的基因盒携带情况，江苏、浙江、福建和海南分离株的基因盒以arr-3、dfr16、dfrA27和aadA2为主[14-15]，赵姝等[17]在半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)源弧菌中检出dfr16、aadA2、arr-3和dfrA27等基因盒，韩国的菲律宾帘蛤(Ruditapesphilippinarum)源弧菌主要携带blaCTX-M、blaTEM和aadA2等基因盒[19]。本研究中，int1和qacEΔ1基因在广西北海市、钦州市和防城港市菌株中的检出率差异显著，可能与不同地区虾塘受含有int1基因和qacEΔ1基因的污水污染程度不同有关。已有报道，从医院污水、猪鱼混养池水中分离获得的细菌均携带有I型整合子及相关基因盒，且污水中的I型整合子很难去除[26-27]。I型整合子的流行加剧了广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌产生多重耐药的可能性，实行生态养殖、严格规范使用抗生素、避免养殖用水受污染等应是目前控制广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌中I型整合子及相关耐药基因传播的有效措施。

3.3 凡纳滨对虾源副溶血弧菌整合子—基因盒与耐药表型的相关性

根据相关性分析结果可知，广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌int1阳性菌株对甲砜霉素的耐药率显著高于int1阴性株，说明凡纳滨对虾源副溶血弧菌对甲砜霉素的耐药机制与I型整合子存在密切联系。除甲砜霉素外，int1基因与其余抗菌药物的耐药表型间均未检测到显著相关性，与已报道的人医临床分离大肠杆菌[28-29]和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginesa)[30]存在差异。究其原因可能是虾塘副溶血弧菌所受的抗生素选择压力比医院临床细菌小，其整合子捕获和积累耐药基因盒的概率也相对较小[28]。本研究中5种磺胺类耐药表型与sul1基因间也无显著相关性，应与sul1基因位于I型整合子的3′末端、其表达可能受到启动子种类、强弱和距离的影响[31]，以及分离株还可能存在其他磺胺类耐药机制有关。qacEΔ1基因属于季铵盐类耐药基因，本研究中携带qacEΔ1基因的凡纳滨对虾源副溶血弧菌是否对季铵盐消毒剂耐药尚需进一步探究证实；在int1、sul1和qacEΔ1基因均为阳性的23株凡纳滨对虾源副溶血弧菌中，基因盒blaCTX-M-2和blaVIM-60与头孢拉定耐药表型、基因盒aadA1和aacA与新霉素耐药表型间无显著相关性，但出现部分携带aadA1和aacA的菌株对新霉素敏感、携带blaCTX-M-2的菌株对头孢拉定敏感的现象。类似现象在大肠杆菌的人类临床分离株[28]和腹泻犬源分离株中也有报道[32]，可能是由耐药基因的低水平表达或基因沉默所引起[28]。影响基因盒表达水平的因素包括可变区启动子Pc和二级启动子P2的强弱及基因盒与启动子的距离远近等，基因盒离启动子越近则表达水平越高，反之则越低[31]。尽管本研究中凡纳滨对虾源副溶血弧菌对大部分抗菌药物的耐药表型与int1基因间未检测到显著相关性、基因盒与相应抗菌药物的耐药表型间相关性也不显著，但整合子—基因盒的存在给广西凡纳滨对虾副溶血弧菌疾病防控带来的风险仍需引起高度重视。为了尽可能控制凡纳滨对虾源副溶血弧菌多重耐药状况加剧，建议在对虾养殖过程中应加强对弧菌整合子—基因盒的监控，对整合子—基因盒的消除方法进行深入探讨，严格控制抗生素的使用，避免养殖用水污染，以提高凡纳滨对虾副溶血弧菌病的防控效率。

4 结 论

广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌对16种抗菌药物表现出不同程度的敏感性，其中对氟苯尼考的敏感性最高，可考虑将该抗菌药物作为广西凡纳滨对虾副溶血弧菌病防治的备选药物。凡纳滨对虾源副溶血弧菌对大部分抗菌药物的耐药表型与int1基因间未检测到显著相关性、基因盒与相应抗菌药物的耐药表型间的相关性也不显著，但I型整合子的流行加剧了广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌产生多重耐药的可能性，因此应加强对弧菌整合子—基因盒的监控。