不同清洗方式对三七主根重金属及药效成分含量影响

孙兆帅，杨 野，田梦媛，代春艳，石 玥，汪 瑞，官会林*

(1.云南师范大学，云南省农村能源工程重点实验室，云南 昆明 650500；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

【研究意义】三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]是五加科人参属植物，主要种植于云南和广西[1]，三七的干燥根和根茎含多种丰富的化学成分，如皂苷、挥发油、三七素、氨基酸、甾醇类等，其中皂苷是最主要药效成分，目前已从其不同部位分离出60多种单体皂苷[2]。三七对心、脑血管疾病有较好的疗效[3]，在国内外拥有极高的声誉，是中国出口的大宗药材之一，近年来其出口量呈快速增长的趋势[4]。然而，重金属超标现象在三七药材中偶有发生，让消费者对三七的安全性产生了质疑[5]。有研究表明，根表面粘土中的重金属是三七重金属的主要来源[6]。因此，洗净三七根表泥土，就能极大限度地降低三七中重金属含量。【前人研究进展】三七传统的加工方式为将鲜三七根表泥土抖落，分成不同部位晒干，再用锉刀把表面泥土打磨干净。该方式较为费力，且锉刀附着的泥土杂物容易在打磨过程中再次进入三七中，从而存在重金属超标的风险[7]。赵刚等[9]超声提取蔬菜中的重金属；曾清如等[10]采用不同浓度酸去除烟草、牧草等植物中的重金属。随着人们对重金属安全意识的增加，有人使用清水浸泡和流水清洗来清除三七根表泥土，这2种方法可有效清洗三七，但容易使三七中皂苷类成分流失[8]。【本研究切入点】在其他药材或其他农产品中，发现超声波清洗样品，调整清洗溶液pH值、螯合剂浓度等，可以有效清除重金属。然而，这些清洗方式是否适用于三七清洗仍未知。【拟解决的关键问题】以打磨处理三七主根为对照组，采用不同超声时间、不同pH清洗液以及不同浓度乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)清洗三七，测定其镉(Cd)、砷(As)、铜(Cu)、铅(Pb)含量以及各皂苷含量，探索减少三七重金属含量最大限度，最低限度减少皂苷损失的清洗条件，为三七的清洗方式提供参考，以促进三七药材的出口。

1 材料与方法

1.1 供试材料

三七主根样品于2017年11月购自云南文山三七市场。

1.2 测试仪器和标样

高效液相色谱仪(HPLC-1260 infinity ，Agilent，美国)，原子吸收光谱仪(Agilent 240 Duo AAS Agilent，美国)，原子荧光光谱仪(AFS-F69B5，湖北汇瑞通光电科技有限公司)。Pb、Cd、Cu、As标准溶液(100 μg/mL，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院)，对照品R1(CAS：80418-24-2，纯度： HPLC≥98 %)、Rg1(CAS：22427-39-0，纯度：HPLC≥98 %)、 Re(CAS：52286-59-6，纯度：HPLC≥98 %)、Rb1(CAS：41753-43-9，纯度：HPLC≥98 %)和Rd(CAS：52705-93-8，纯度：HPLC≥98 %)均购自四川省维克奇生物科技有限公司，乙腈为色谱纯，其他试剂均为优级纯。

1.3 处理方法

1.3.1 不同时间超声清洗三七主根 将7组鲜三七主根依次超声清洗0、1、2、4、6、8、10 min；超声完成后，依次将每组三七用玻璃棒搅拌10、9、8、6、4、2、0 min，再流水冲洗3 min，干燥后打粉，每组处理重复3次。

1.3.2 不同pH值水溶液清洗三七主根 分别使用pH值为2.00、4.00、6.00、7.00、8.00、10.00、12.00的水溶液清洗鲜三七主根6 min，干燥后打粉，每组处理重复3次。

1.3.3 不同浓度EDTA-2Na溶液清洗三七主根 分别使用浓度为0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mol/L的EDTA-2Na溶液清洗鲜三七主根6 min，干燥后打粉，每组处理重复3次。

1.3.4 打磨处理三七主根 以打磨处理三七主根为对照，即选取质量合适的三七主根，使用锉刀进行打磨，搓掉表皮及泥土杂物后干燥打粉，重复3次。

1.4 重金属含量测定

根据GB 5009.12-2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》、GB 5009.15-2014《食品安全国家标准 食品中镉的测定》、GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》和GB 5009.13-2017《食品安全国家标准 食品中铜的测定》的测定方法，对三七样品中Pb、Cd、As和Cu含量进行测定。Pb、Cd和Cu含量测定采用原子吸收光谱仪进行测定，As含量测定采用原子荧光光谱仪进行测定。

1.5 药效成分的测定

1.5.1 供试品溶液的制备 精密称取三七粉0.2 g，置于10 mL离心管中，加入甲醇5 mL，称定质量，摇匀，超声30 min，继续加甲醇补足损失的质量，摇匀，于3000 r/min离心5 min，再由0.45 μm微孔滤膜滤过可以得到供试品溶液，待测。

1.5.2 色谱条件 HPLC条件为Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色谱柱(美国Thermo Scientific公司，250 mm×4.6 mm，5μm)。流动相：水(A)-乙睛(B)。线性梯度洗脱：(0 ～20 min，20 %B；20～45 min，20 %～46 %B；45 ～55 min： 46 % ～55 %B；55～60 min：55 %B)。检测波长：203 nm。流速：1.0 mL/min。进样量：10 μl。

1.5.3 方法学考察 精密量取对照品溶液 3、5、8、10、13、15 μl进行测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得三七皂苷 R1和人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd回归方程分别为y=3107088x+39382(R2=0.9996)，y=3710214x+59857(R2=0.9994)，y=2786843x+47939(R2=0.9994)，y=2344051x+ 51125(R2=0.9992)，y=2728930x+50515(R2=0.9992)。日内和日间精密度RSD均<5.0 %，供试样品溶液在12 h内基本稳定，样品加样回收率97 %～102 %,表明建立的含量测定方法可靠。

表1 不同超声时间清洗三七主根对其重金属含量及药效成分影响

注：同列后不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters after the same column indicated significant difference (P<0.05), the same as below.

2 结果与分析

2.1 不同超声时间清洗三七主根对其重金属含量和药效成分影响

由表1显示，对照As、Cu、Pb含量均低于安全限量标准，Cd含量超标。不同超声时间清洗三七主根As、Cu、Cd、Pb含量都低于安全限量标准。与对照相比，超声0、1 min条件下Cu含量分别为(4.26±0.06)、(4.11±0.09)mg/kg，显著高于对照8.3 %、4.6 %；超声0、1、2 min条件下Pb含量分别为(4.19±0.14)、(3.85±0.28)、(3.55±0.07)mg/kg，显著高于对照37.4 %、26.2 %、16.2 %；其余超声条件下As、Cu、Cd、Pb含量都显著低于对照。随超声清洗时间增加，各超声条件下重金属的平均去除率呈上升趋势，但在超声时间大于6 min后上升趋势不显著，在超声10 min条件下达到最高，为62.8±1.51 %。超声8、10 min时，总皂苷含量分别为(6.61±0.13)%、(6.49±0.20)%，低于对照0.2 %和2.2 %，无显著性差异；其他超声条件下总皂苷含量均显著高于对照。总皂苷损失率表现为随超声时间增加不断升高，超声0 min时总皂苷损失率最低，为-21.5 %±1.45 %。

表2 不同pH值水溶液清洗三七主根对其重金属含量及药效成分影响

表3 不同浓度EDTA-2Na溶液清洗三七主根对其重金属含量及药效成分影响

2.2 不同pH值水溶液清洗三七主根对其重金属含量和药效成分影响

由表2显示，不同pH值条件下清洗三七主根As、Cu、Pb含量都低于安全限量标准，Cd含量在pH值为8、10、12时超过安全限量标准，分别为(0.41±0.04)、(0.45±0.02)、(0.49±0.03)mg/kg。与对照相比，所有处理As、Cu、Cd、Pb含量都显著低于对照。随着清洗液pH的升高，各处理重金属的平均去除率呈下降趋势，pH值为2～6和8～12时，平均去除率下降趋势不显著，在清洗液pH值为4时平均去除率最高，为57.2 %±0.79 %。清洗液pH值为10、12时，总皂苷含量分别为6.59 %±0.16 %、6.53 %±0.03 %，低于对照0.6 %、1.6 %，无显著性差异，其他处理下总皂苷含量均高于对照，除pH值为8的处理皆差异显著。总皂苷损失率随pH值增加先降低再升高，在pH值6时最低，为-23.7 %±2.39 %。

2.3 不同浓度EDTA-2Na溶液清洗三七主根对其重金属含量和药效成分影响

表3显示，不同浓度EDTA-2Na溶液清洗三七主根As、Cu、Pb含量均低于安全限量标准，在EDTA-2Na浓度为0、0.005、0.01 mol/L条件下，Cd的含量超过安全限量标准，分别为(0.63±0.02)、(0.54±0.02)、(0.32±0.02)mg/kg。与对照相比，EDTA-2Na浓度为0 mol/L时，As、Cu、Pb含量分别为(0.63±0.02)、(3.95±0.07)、(3.09±0.06)mg/kg，高于对照4.1 %、0.4 %、1.2 %，均无显著性差异。EDTA-2Na浓度为0.005 mol/L时，Cu含量为(3.95±0.06)mg/kg，高于对照0.4 %，差异不显著。EDTA-2Na浓度为0.01、0.02 mol/L时，Cu含量分别为(3.86±0.03)、(3.85±0.03)mg/kg，低于对照1.8 %、2.1 %，均无显著性差异。其他处理下As、Cd、Cu、Pb含量均低于对照，差异显著。随着EDTA-2Na浓度升高，重金属的平均去除率呈上升趋势，但EDTA-2Na浓度大于0.05 mol/L后上升趋势不显著，浓度达到0.2 mol/L时，重金属去除率最高，为54.4 %±3.16 %。该处理下总皂苷含量均显著高于对照。随着EDTA-2Na浓度变化，总皂苷损失率并没有显著变化趋势。

3 讨 论

三七传统干燥方式是将新鲜采挖的三七在晒场上摊开、修剪(将剪口、主根和筋条分开)直至干燥，或将修剪后的剪口和主根在烤房中干燥。对于干燥后的三七，通常采用打磨的方式去除表面附着的泥土。因而，三七产地加工中鲜见清洗操作环节，仅少数饮片厂可见。研究发现三七根表浮土是药材中重金属主要来源[6]，故通过清洗的方式去除根表浮土是有效控制重金属含量的重要途径之一。曾宪彩等[7]曾研究比较过流水与浸泡清洗对三七剪口重金属清除和皂苷损失的影响。但三七清洗过程操作仍缺乏科学数据支撑。

通过对超声波清洗三七主根实验考察，发现随超声波作用时间增加，清洗后三七主根As、Cu、Cd、Pb的平均去除率和总皂苷损失率均呈上升趋势，但在6 min后4种重金属元素去除率趋于稳定。即一定范围内延长超声清洗时间可降低三七主根重金属含量，同时亦造成了皂苷的损失。邵玉芳等[11]研究表明超声波对蔬菜中重金属的提取率在一定时长内随超声时间增加，亦验证了本研究结果。这是超声波在液体介质传播中产生空化效应，对清洗物表面进行撞击、剥离，从而随超声时间增加不断加强对重金属的去除效果直至最大值[12-14]。三七皂苷具有较好的水溶性，超声作用会加剧皂苷水溶现象，从而增加皂苷的损失率。马妮等[15]研究也表明三七皂苷的提取率随超声时间的增加而增加。因而，在保障三七药材重金属含量符合标准的条件下应尽量降低超声清洗时间以减少皂苷损失。

Jing Yuan[16]等研究发现用0 %、0.1 %、0.25 %、0.5 %、1 % 5种浓度盐酸萃取油菜籽中重金属，重金属萃取效率随盐酸浓度升高而增加。从实验结果表明，水溶液pH值不超过7时，清洗后三七重金属含量均未超标，且随水溶液pH值增加，重金属的平均去除率呈下降趋势。这种现象是由于低pH环境有利于重金属的迁移及释放，高pH环境会提高重金属的稳定性[17-18]。实验发现在水溶液pH值6时，三七主根总皂苷损失率最小，即皂苷损失在弱酸酸环境中较少。这是由于皂苷水溶液呈弱酸性，在碱性条件下，皂苷上的OH-以阴离子-O-形式存在，无法与离子液体的阴离子产生氢键；而强酸条件下，糖键易发生断裂，发生水解[19]。因此，综合考虑重金属的去除和皂苷的保留，以使用弱酸性清洗液清洗三七为宜。

螯合剂可使重金属离子生成性质完全不同的螯合物，主要应用于重金属元素的萃取[20]。如文陈兆慧等[21]采用吡咯烷二硫代氨基甲酸铵-二乙基二硫代氨基甲钠-甲基异丁基甲酮(APDC-DDTC-MIBK)螯合萃取茜草，以准确测定茜草中Pb的含量。雷鸣等[22]研究也表明在EDTA浓度为0～0.02 mol/L时，对土壤重金属萃取率急速上升，而在0.05 mol/L处，萃取效率则基本达到平衡。使用不同浓度的EDTA-2Na清洗三七主根，随EDTA-2Na浓度升高，重金属的平均去除率呈上升趋势，在EDTA-2Na浓度大于0.05 mol/L后趋于平缓，而总皂苷损失率则无明显变化趋势。即增加EDTA-2Na浓度可以在一定范围内减少三七的重金属含量，且对皂苷含量无明显影响。说明EDTA对重金属的去除效果随浓度增加有最大值，需要选取合适的浓度进行清洗来节约成本，清洗三七主根的EDTA-2Na浓度以0.05 mol/L为宜。

4 结 论

确保三七药材重金属含量在允许标准规定之下应尽量降低超声清洗时间以减少皂苷损失；使用弱酸性水清洗三七可以保证药材重金属不超标并能最大限度保留皂苷成分；使用浓度0.05 mol/L EDTA-2Na溶液清洗三七主根能保证重金属清洗效果并节约成本。