气不摄血证免疫性血小板减少症患者血管活性物质及相关炎症因子变化与临床意义＊

王洪志，朱世荣，2，胡晓梅＊＊，王明镜，3，谌海燕，全日城，丁晓庆，赵 攀，3，范 腾，3，李雨蒙，2，郭小青，姜云耀

（1.中国中医科学院西苑医院 北京 100091；2.北京中医药大学 北京 100029；3.中国中医科学院研究生院 北京 100700；4.北京中医药大学东方医院 北京 100078）

免疫性血小板减少症是常见的免疫介导的出血性疾病，以骨髓中巨核细胞成熟障碍，外周血小板计数减少为特点，多有皮肤黏膜、内脏甚至脑出血等表现。中医学多以出血为切入点，基于气血相关理论，从气血失衡，血溢脉外认识该病，将本病归为“血证”、“发斑”、“紫癜”等范畴，气不摄血证是ITP常见证型[1]。现代医学主要是从免疫失衡、血管功能障碍等方面认识该病。血管内皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶、血管内皮生长因子（VEGF）等是维持血管内皮功能与受损修复的重要血管活性物质[2-3]，而一些炎症因子对血管功能亦具有直接或间接调节作用[4-5]。本研究从血管活性物质及相关炎症因子入手，探讨气不摄血证ITP患者血管内皮功能变化及其意义。

1 材料与方法

1.1 诊断标准

西医ITP诊断标准：参照《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》[6]。

中医气不摄血证ITP证候诊断标准：参照国家中医药管理局2010年中医血液病重点专科紫癜病（免疫性血小板减少症）中医诊疗方案[7]。

1.2 纳入标准

本研究纳入标准：①符合西医免疫性血小板减少症诊断标准及中医气不摄血证紫癜病诊断标准；②年龄在18～75岁之间；③自愿签署知情同意书。

1.3 ITP出血分组标准

参照《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2016年版）》[2]将ITP患者依据出血程度分为未出血组、低危组（≤2分）及高危组（＞2分）。

1.4 排除标准

本研究排除标准：①严重消化道和（或）脏器出血；②合并严重心、肝、肾等脏器功能不全者；③精神病患者；④过敏体质、妊娠或哺乳期妇女；⑤正在参加其他临床研究者。

1.5 一般资料

筛选2016年12月至2017年6月期间中国中医科学院西苑医院及北京中医药大学东方医院就诊，且符合气不摄血证ITP患者30例（试验组）。其中，男性12例、女性18例，年龄18～65岁，中位年龄为46岁，血小板计数(19.25～44.75)×109/L。22例患者有出血症状，根据2016版ITP出血评分量表，将30例ITP患者分为未出血患者8例、低危患者14例及高危患者8例。凝血酶原时间（11.5～13秒）、活化部分凝血活酶时间（21.9～32.8秒）、凝血酶时间（15～17.2秒）以及纤维蛋白浓度（2.43～3.68 g/L）均在正常范围。对照组20例为我院健康志愿者（对照组），男性8例，女性12例，年龄21～55岁，中位年龄45岁，血小板计数122～230×109/L。对照组与试验组在年龄、性别相比均无显著差异（P＞0.05）。

本研究获得中国中医科学院西苑医院临床研究伦理委员会批准（2015XLA108-2），并在中国临床试验注册中心注册（ChiCTR-IOR-17014236）。

1.6 主要实验试剂及仪器

NO/NOS、ET-1试剂盒由北京洛奇检验所有限公司提供。（NO试剂盒：A012-1-2，NOS试剂盒：A014-2-2,南京建成生物工程研究所；ET-1试剂盒：QETOOB，R&D systems,Inc）。细胞因子IL-8、IL-10、IL-17A、TNF-α、VEGF-A、VEGF-D试剂盒由北京旷博生物有限责任公司提供。Aimplex®Human custom 15-plex kit（T1C156701北京旷博生物技术股份有限公司）；Aimplex®TGFbeta1 1-plex kit（B111206北京旷博生物技术股份有限公司）；MS3数显型振荡器（3319000德国IKA公司）；高速冷冻离心机（GL-16G瑞江分析仪器有限公司）；涡旋器（QL-902其林贝尔仪器制造有限公司）；Aimplex®EZPrep洗板仪（VM1001北京旷博生物技术股份有限公司）；流式细胞仪（NovoCyte D1040艾森生物有限公司）。

1.7 实验方法

抽取外周血5 mL，混匀后全血离心(3000 r/min，4℃l0 min)，分离血浆。细胞因子IL-8、IL-10、IL-17A、TNF-α、VEGF-A及VEGF-D检测按照AimPlex测试说明书进行，酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测周血中NO、NOS以及ET-1，具体操作按照说明进行。

1.8 统计学方法

本研究采用SPSS22.0统计软件处理数据，实验结果以均数±标准差()表示。气不摄血证ITP组与对照组的比较采用独立样本T检验，多组之间的比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 气不摄血证ITP患者血管活性物质NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D的变化

为了解气不摄血证ITP组患者血管活性物质NO、NOS、ET-1、VEGF-A及VEGF-D的含量，本研究应用ELISA法测定了NO、NOS、ET-1含量，AimPlex流式高通量多细胞因子检测技术检测了血清VEGF-A及VEGF-D含量。结果显示，与对照组相比较，气不摄血证ITP组NOS、VEFG-A含量显著降低（P＜0.05），ET-1含量显著增高（P＜0.05），NO、VEGF-D含量未见显著差异（P＞0.05），见表1。

2.2 气不摄血证ITP患者血管相关性炎症因子IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α的变化

为了解气不摄血证ITP血管相关炎症因子IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量，本研究应用AimPlex流式高通量多细胞因子检测技术检测了血清IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量。结果显示，与对照组相比较，气不摄血证ITP组患者IL-10含量显著降低（P＜0.05），而IL-8、IL-17A及TNF-α含量显著增高（P＜0.05）。见表2、图1。

2.3 气不摄血证ITP未出血、低、高危出血患者血管活性物质NO、NOS、ET-1、VEGF-A及VEGF-D的变化

为了解气不摄血证ITP患者出血程度与NO、NOS、ET-1、VEGF-A及VEGF-D含量的关系，本研究比较分析了未出血组、低高危出血组患者上述指标的变化。结果显示，高危组患者ET-1含量显著高于未出血患者（P＜0.05），其余血管活性物质含量在三组患者中未见显著差异（P＞0.05），见表3。

表1 气不摄血证ITP组与对照组NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量

表1 气不摄血证ITP组与对照组NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量

注：*：与对照组相比，P＜0.05

VEGF-D/(pg·mL-1)6.83±1.11 6.18±2.24分组对照组ITP组n 20 30 NO/(µmol·L-1)65.49±20.41 61.33±19.46 NOS/(u·mL-1)26.30±01.47 21.32±1.51*ET-1/(pg·mL-1)0.95±0.66 1.02±0.82*VEGF-A/(pg·mL-1)31.12±7.37 12.94±5.92*

表2 气不摄血证ITP组与对照组IL-10、IL-8、IL-17A以及TNF-α含量

表2 气不摄血证ITP组与对照组IL-10、IL-8、IL-17A以及TNF-α含量

注：*：与对照组相比，P＜0.05

TNF-α/(pg·mL-1)2.49±0.41 3.95±2.70*分组对照组ITP组n 20 30 IL-10/(pg·mL-1)5.19±0.51 3.57±0.67*IL-8/(pg·mL-1)23.48±6.15 778.01±143.84*IL-17A/(pg·mL-1)147.97±19.66 217.70±33.08*

表3 气不摄血证ITP患者三组NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量

表3 气不摄血证ITP患者三组NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量

注：*：与对照组相比，P＜0.05

VEGF-D/(pg·mL-1)6.34±1.94 6.95±1.18 6.16±2.24分组未出血组低危出血组高危出血组n 8 1 4 8 NO/(µmol·L-1)60.55±17.11 60.20±15.04 63.92±15.49 NOS/(u·mL-1)20.89±2.04 21.37±0.88 21.01±2.05 ET-1/(pg·mL-1)0.97±0.09 0.99±0.06 1.18±0.42*VEGF-A/(pg·mL-1)12.81±3.11 13.46±1.75 13.08±4.54

图1 应用AimPlex流式高通量技术检测IL-10，IL-8，IL-17A以及TNF-α表达

2.4 气不摄血证ITP患者出血与NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D之间的回归分析

为进一步了解气不摄血证ITP患者出血与上述指标的关系，本研究将气不摄血证ITP患者分为出血组及未出血组，并分析出血与上述指标的关系。结果显示，气不摄血证ITP患者出血与ET-1及VEGF-A含量相关(P＜0.05)，但与NO、NOS及VEGF-D含量未见显著相关性（P＞0.05），见表4。

2.5 气不摄血证ITP未出血、低高危出血患者血管相关性炎症因子IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α的变化

为了解气不摄血证ITP患者出血程度与IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量的关系，本研究比较分析了未出血组、低、高危出血组患者上述指标的变化，结果显示，三组患者在IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α表达上未见显著差异（P＞0.05），见表5。

表4 气不摄血证ITP患者出血与NO、NOS、ET-1、VEGF-A、VEGF-D含量回归分析

2.6 气不摄血证ITP患者出血与IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α之间的回归分析

为进一步了解气不摄血证ITP患者出血上述指标的关系，本研究将气不摄血证ITP患者分为出血组及未出血组，并分析出血与上述指标的关系。研究结果显示，气不摄血证ITP患者出血与上述炎症因子含量未见显著相关性（P＞0.05），见表6。

3 讨论

免疫性血小板减少症，是临床上常见的由细胞免疫、体液免疫介导的获得性出血性疾病。随血小板减低程度加大，其出血风险逐渐增加[8-9]。临床上，我们发现有些患者血小板计数在安全范围却有很明显的出血倾向，而一些患者血小板计数很低但出血倾向不明显。本研究推测ITP患者出血除了与血小板计数有关外，可能与血管内皮功能有关。本研究从主要血管活性物质及相关炎症因子入手，应用2016版ITP出血评分量表对ITP患者出血程度进行划分，初步探讨气不摄血证ITP患者主要血管活性物质、炎症因子变化对出血的影响。

血管活性物质在保持血管的正常状态和功能中发挥重要作用[10]。NO是已知最强的血管舒张因子，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化氧化还原反应生成的，具有一定的松弛血管及抑制血小板的活化的作用[11]。ET-1是已知最强的缩血管活性短肽，可激活血浆中的单核细胞，促使其产生炎性因子，而炎性因子分泌水平的上调又会导致ET-1水平升高，形成恶性循环，损害血管内皮细胞[12-13]。若ET及NO表达异常，则血管舒缩功能失衡，造成血管内皮功能紊乱，进而导致血管壁完整结构破坏引发出血[14]。VEGF-A是促进血管生成的重要因子，当血管受损时，机体会产生大量VEGF-A，通过增加血管通透性加快内皮细胞迁移对受损的组织进行修复[15-16]。VEGF-D主要通过与内皮细胞上的VEGFR-2、VEGFR-3的结合并使之激活，产生脉管系统的增生[17]。

本研究结果表明，与正常对照组相比较，气不摄血证ITP患者ET-1表达显著增高（P＜0.05），NOS表达显著下降（P＜0.05），但NO表达未见明显差异（P＞0.05）。可能是因为ET-1的高表达使血管收缩，加剧了血管缺血缺氧，从而抑制内皮型NOS(eNOS)活性，进而降低体内NOS水平，减少NO产生，使NO/ET轴紊乱，导致血管舒缩功能障碍，加重了ITP患者出血[10,18]。同时发现，高危出血组患者ET-1表达水平显著高于未出血患者（P＜0.05），气不摄血证ITP患者出血与ET-1表达相关，这揭示了ET-1的高表达对血管内皮潜在的损害作用。同时，与对照组相比，VEGF-A表达显著降低（P＜0.05），VEGF-D表达未见显著差异（P＞0.05），气不摄血证ITP患者出血与VEGF-A表达相关，这提示VEGF-A参与到ITP血管内皮损伤的进程中，但如何发挥作用尚需研究。

除血管活性物质外，部分炎症因子与血管活性物质密切相关，可损伤血管内皮，引起出血[4-5]，如NO促进Th2亚型可释放产生IL-10[19-20],而IL-17A可直接促进VEGF表达[21-24]。TNF-α既促进NOS、ET-1及VEGF表达，同时，ET-1升高亦能促进IL-8、TNF-α等炎性介质释放，启动并放大炎症反应[21-26]。另有文献报道，大量TNF-α的产生与释放会破坏机体免疫平衡，造成血管功能异常[27-28]；IL-17A促进炎性和粘附分子释放，从引起机体的组织炎性细胞浸润，加剧血管损伤[29-30]。

表5 气不摄血证ITP患者三组细胞因子IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量

表6 气不摄血证ITP患者出血与IL-10、IL-8、IL-17A及TNF-α含量回归分析

结果显示，正常对照组相比较，气不摄血证ITP患者IL-10表达水平显著下降（P＜0.05），而TNF-α、IL-8、IL-17A表达显著增高（P＜0.05）。高表达的TNF-α可以下调NOS的表达，这也解释了NOS低表达的原因。同时，由血管相关炎症因子可以看出，气不摄血证ITP患者存在多种炎症因子如TNF-α、IL-8、IL-17A的高表达，IL-10抑炎相关因子低表达，促炎与抑炎表达失衡进一步加剧血管损伤，导致出血。

ITP病证中气虚到气不摄血、血溢脉外是一个由轻到重的连续性变化过程，其病机过程体现着“气为血帅，血为气母”的气血相关病证理论。临床上气不摄血是ITP常见证型，益气摄血是临床治疗ITP常用的治法[1]。气不摄血证ITP患者存在ET轴及NO系统信号通路功能紊乱以及血管内皮表达异常，上述研究表明，通过益气摄血法来调节ET轴及NO系统信号通路，可能是临床治疗气不摄血证ITP的一个重要途径。