不同蛋白酶对复合骨素酶解液呈味物质的影响

余江泳　李晓瑞　刘贵珊　王梓　郭美　靳维一　董琪

摘 要：为研究不同蛋白酶对复合骨素（牛骨素和鸡骨素）酶解液呈味物质的影响，选取复合蛋白酶（P）、菠萝蛋白酶（B）和复合风味蛋白酶（F），制备单一和组合酶解液，对酶解液肽分子质量分布、核苷酸含量、游离氨基酸含量等呈味物质指标进行综合评价。结果表明：P+F组酶解液的水解度最大，酶解液中小分子质量肽（<200 Da）分布比例最大;P+F组酶解液的游离氨基酸含量最高，鲜味和甜味氨基酸是复合骨素酶解液的主要呈味成分;P+F组的5-核苷酸（5-肌苷酸、5-鸟苷酸、5-腺苷酸）总含量较高。因此，复合蛋白酶和复合风味蛋白酶处理的复合骨素酶解液整体风味最佳。

关键词：复合骨素;蛋白酶;酶解液;肽分布;核苷酸;游离氨基酸

Abstract： In order to investigate the effect of different proteases on taste compounds of enzymatic hydrolysates of a mixed bovine and chicken bone extract， protamex （P）， bromelain （B） and flavourzyme （F） were used singly and in combination for enzymatic hydrolysis. The resulting hydrolysates were evaluated by measuring their peptide molecular mass distribution， nucleotide and free amino acid contents as taste compounds. The results showed that P + F led to the highest degree of hydrolysis of the mixed extract and small peptides （< 200 Da） accounted for the highest proportion of total peptides in the hydrolysate. This hydrolysate contained the highest content of free amino acids with fresh and sweet amino acids being major taste compounds， as well as higher contents of total 5-nucleotides （5-inosinemonophosphate， 5-guanosinemonophosphate and 5-adeninemonophosphate）. Therefore， P + F treatment imparted the best flavor in enzymatic hydrolysates.

Keywords： mixed chicken and bovine bone extract; proteases; enzymatic hydrolysates; peptide distribution; nucleotides; free amino acids

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200314-069

中图分类号：TS201.2                                     文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2020）05-0001-05

我国已成为世界肉类生产和消费大国，肉制品骨副产物的年产量2 000多万t，骨资源极为豐富。骨中富含维生素、矿物质、钙磷盐等天然营养成分，加工利用价值较高[1]。目前，骨加工设备和技术水平有限，大多数骨经过粗加工直接作为动物饲料，骨资源利用率较低。因此，提高骨附加值，开发天然绿色骨产品，对增加肉类企业的经济效益具有重要意义[2]。

骨类产品主要有骨素、骨泥、骨粉等，其中骨素是以畜禽骨为原料，经过加热浸提、离心分离油脂后浓缩制得的一种富含氨基酸、微量元素、风味物质的初级骨提取物，是生产肉类呈味基料的优质原料[3]。目前，骨素及骨提取物在食品调味料生产、骨类产品开发中逐渐成为研究热点。唐春红等[4]分析鸡骨素酶解液酶解产物的风味和功能组分生成机制，为鸡骨的加工利用提供了理论依据;Xu Xinru等[5]在牛骨提取物的水解产物中发现了呈味物质，表明寡肽在肉汤中具有风味增浓、增香的作用;Sun Hongmei等[6]研究鸡骨酶解后的骨提取物风味品质，结果表明，酶解过程增加了鲜味，改善了苦味，提高了酶解液风味的整体稳定性。因此，酶解过程不但可以使骨提取物中的多肽和游离氨基酸等呈味物质最大限度地保留，而且对改善后期得到的香精香料风味具有重要作用[7]。目前多数研究报道集中在单一骨素酶解液的滋气味成分特性方面，关于以复合骨素为原料的酶解液呈味物质组分研究鲜见报道。

本研究将牛骨素和鸡骨素复合，制备肉味更加浓郁、滋味更加醇厚的复合骨素，选取复合蛋白酶、菠萝蛋白酶和复合风味蛋白酶，制备单一和组合酶解液，利用高效液相色谱仪、氨基酸自动分析仪等设备对酶解液核苷酸含量、肽分子质量分布、游离氨基酸含量等呈味物质指标进行综合评价，为复合骨素的酶解、酶解液呈味物质的组分分析以及骨副产物高值化加工利用、衍生产品开发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清汤型牛骨素和鸡骨素 抚顺独凤轩骨神生物技术股份有限公司;复合蛋白酶（47 500 U/g）、复合风味蛋白酶500 MG（25 000 U/g）、菠萝蛋白酶（600 000 U/g）（均为食品级） 丹麦诺维信公司;葡萄糖（食品级） 源叶生物科技有限公司。

2-甲基-3-庚酮、混合氨基酸、5-鸟苷酸（5-guanosinemonophosphate，5-GMP）、5-肌苷酸（5-inosinemonophosphate，5-IMP）、5-腺苷酸（5-adeninemonophosphate，5-AMP）、肽（甘氨酸、抑肽酶、细胞色素C、杆菌肽、谷胱甘肽）标准品 美国Sigma公司;甲醛、氢氧化钠、磺基水杨酸、盐酸、磷酸二氢钾、三氟乙酸 国药集团化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA224S-CW电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;HH-4数显恒温水浴锅、JI-1精密增力电动搅拌器 国华电器有限公司;1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司;Sniffer 9000嗅闻仪 瑞士Brechbuhler公司;DB-wax毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国J&W公司;TSK gel G2000 SWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm，5 μm） 日本Tosoh公司;Kjeltec-8100全自动凯氏定氮仪 丹麦Foss公司;L-8900氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 复合骨素酶解液的制备

选取牛骨素70 g、鸡骨素30 g，添加100 mL蒸馏水进行稀释，在自然pH值条件下采用6 组酶进行处理，按表1的条件酶解，水浴1 h后，再90 ℃水浴灭酶10 min，制得6 种复合骨素酶解液。P+F、B+F和P+B+F复配酶的酶活力比分别为1∶1、1∶1和1∶1∶2。

1.3.2 水解度测定

采用甲醛滴定法[8]测定复合骨素酶解液氨基酸态氮含量。准确吸取5 mL酶解液至容量瓶，用蒸馏水定容至100 mL，取20 mL稀释液加入60 mL蒸馏水混匀，在磁力搅拌器搅拌状态下，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.2，加入10 mL甲醛溶液后继续滴定至pH 9.2，记录消耗的NaOH溶液体积。以80 mL蒸馏水为对照，在相同条件下进行空白滴定实验。氨基酸态氮含量按式（1）计算。

V为吸取试样的体积/mL;V1为滴定时溶液pH 8.2～9.2所消耗的NaOH溶液体积/mL;V2为空白滴定实验中，溶液pH 8.2～9.2所消耗的NaOH溶液体积/mL;V3为参与反应的稀释液体积/mL;V4为稀释液的定容体积/mL;c为NaOH溶液浓度（0.05 mol/L）;0.014为与1.00 mL NaOH标准滴定溶液相当的氮的质量/g。

复合骨素酶解液总蛋白质含量通过全自动凯氏定氮仪进行测定，消化程序为200 ℃消化30 min，升温至420 ℃消化1 h。水解度按式（2）计算。

1.3.3 肽分子质量分布测定

参照Chiang等[9]的方法，并稍作修改，采用高效液相色谱仪测定复合骨素酶解液分子质量分布。测定条件：TSK gel G2000 SWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm，5 μm）;柱温40 ℃;流动相：体积分数45%乙腈（体积分数0.1%三氟乙酸配制）;0.5 mL/min恒流速洗脱;进样体积10 μL，检测波长214 nm。以甘氨酸、抑肽酶、细胞色素C、杆菌肽、谷胱甘肽为标准品，建立保留时间（x）和分子质量对数（y）的标准曲线（y=-3.933 1x+27.517 0，R2=0.999 8），根据标准曲线计算肽分子质量。

1.3.4 游离氨基酸含量测定

参照Chungchunlam等[10]的方法，并稍作修改。取2 mL复合骨素酶解液及2 mL质量分数40%磺基水杨酸于10 mL离心管内，10 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液于50 mL离心管中，并用超纯水定容，过0.22 μm滤膜，待氨基酸分析仪上机测定。

分析条件：色谱柱为日立专用离子交换树脂柱（4.6 mm×60 mm，3 μm），检测波长440 nm，0.2 mol/L檸檬酸钠缓冲液，流速35 mL/h，柱温31～76 ℃，茚三酮溶液流速25 mL/h，进样量20 ?L。游离氨基酸含量按式（3）计算。

1.3.5 核苷酸含量测定

参照Chen Dewei等[11]的方法，并稍作修改。取1 mL复合骨素酶解液于50 mL离心管内，加入25 mL超纯水，10 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液于50 mL离心管中，并用超纯水定容，过0.22 μm滤膜，用高效液相色谱仪测定5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP含量。

色谱条件：色谱柱为TSK-gel ODS-80TM（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，紫外检测波长254 nm，进样量10 μL，流速0.8 mL/min;流动相：流动相A为甲醇，流动相B为pH 5.4、0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液;流动相经0.45 μm滤膜过滤后，在室温下超声脱气30 min。采用二元流动相进行梯度洗脱分离;流动相A、B体积比：0 min时0∶100，11 min时10∶90，18 min时0∶100，23 min时0∶100;检测时间23 min。

以峰面积为纵坐标（y），进样量为横坐标（x），绘制标准曲线，计算5-核苷酸（5-IMP、5-GMP和5-AMP）含量。5-IMP回归方程为y=103 764x-96 588（R2=0.999 9），5-GMP回归方程为y=139 286x-116 903（R2=0.999 8），5-AMP回归方程为y=297 755x-183 539（R2=0.999 9）。

1.4 数据处理

采用SPSS 24.0软件进行数据差异显著性分析（P<0.05）;采用Origin 2018软件绘图;每个实验在相同条件下重复进行3 次。

2 结果与分析

2.1 酶种类对复合骨素酶解液水解度的影响

小写字母不同，表示差异显著（P<0.05）。

由图1可知，P+F组复合骨素酶解液水解度与其他处理组差异显著（P<0.05），且水解度最大，達11.27%。原因可能是复合蛋白酶和复合风味蛋白酶的酶解条件较为相似，能够配合发挥最大水解功效[12]。P、B、F、

B+F及P+B+F组5 个处理组间水解度差别不大，分别为9.19%、8.40%、8.88%、8.40%和9.39%。复合蛋白酶是由内切蛋白酶、外切肽酶及风味蛋白酶复合而成的，切割位点较多[13]，因此含有复合蛋白酶的P、

P+F和P+B+F组水解度高于无复合蛋白酶的B、F和B+F组。此外，菠萝蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶，又名巯基蛋白酶，主要作用于肽链中精氨酸和赖氨酸的羧基端，所得酶解液水解度较低[14-15]。

2.2 酶种类对复合骨素酶解液肽分子质量分布的影响

复合骨素经酶解后生成的前体物质肽，可以与氨基酸、核苷酸等风味前体物质发生一系列反应，产生更为丰富的挥发性芳香物质[16]。呈味肽主要分为多肽和寡肽，是从食物中提取或由氨基酸合成的，其中赋予肉品滋味的主要是分子质量小于1 000 Da的寡肽，寡肽与其他呈味物质会发生协同作用，可以丰富酶解液风味，从而使口感适宜[17]。

由表2可知，复合骨素酶解液小分子质量肽（<200 Da）分布比例较大，且P+F组高于其他各处理组。小分子肽对呈味效果具有重要影响，它们不但是鲜味和风味的主要贡献者，而且有的低聚肽是甜味的

主要来源，可以协调其他呈味物质，使滋味更加自然、醇厚[18-19]。分子质量200～1 000 Da肽的分布比例随着肽分子质量的增加而减小，这是由于大多数小分子质量肽是肉滋味的主要呈味物质，与其他分子质量的肽相比，小分子质量肽分布比例最大[20]。复合骨素酶解液中小分子质量肽所占比例越大，代表其水解程度越高，酶解效果越好，其中P+F组分子质量小于1 000 Da的肽段分布比例最高，说明该处理组的2 种酶之间存在一定的肽键互补性[21]，水解度大、酶解效果好，这与水解度分析结果一致。

2.3 酶种类对复合骨素酶解液游离氨基酸含量的影响

游离氨基酸既是食品中重要的营养成分之一，也是重要的呈味物质和风味前体物质，能与其他营养成分产生协同效应，从而改善食品的整体风味[22]。

由表3可知，6 组蛋白酶处理的酶解液中总共检测出17 种游离氨基酸，其中必需氨基酸7 种、半必需氨基酸4 种。不同酶解液间的游离氨基酸总含量具有较大差异，含量从高到低依次为：P+F组>P+B+F组>F组>B+F组>P组>B组。P+F组的游离氨基酸总含量较高，这是由于含有复合蛋白酶的处理组水解度最大，因此在酶解过程中产生的游离氨基酸最多[23]。

呈味氨基酸的含量往往决定了动物蛋白质的鲜美程度。根据游离氨基酸结构特性的不同，常常会呈现出鲜味、甜味、苦味等风味，其中鲜味氨基酸和甜味氨基酸是良好的呈味基料，并且含量越高，得到的酶解液滋味越丰富[24-25]。天冬氨酸和谷氨酸是呈现鲜味的氨基酸，其钠盐具有很强的鲜味，类似味精，有助于改善酸味[26]。P+F组酶解液的天冬氨酸和谷氨酸含量均显著高于其他5 个处理组（P<0.05），这对改善酶解液的滋味特征具有重要贡献。苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸及脯氨酸主要呈现甜味，含有复合蛋白酶处理组上述5 种游离氨基酸总含量较高，其中甘氨酸可以降低酶解液的苦味，改善产品最终的风味效果，丙氨酸可以与鲜味氨基酸相互作用，使肉类产品获得更多的鲜味感[27]。在其余游离氨基酸中，呈现苦味的游离氨基酸种类较多，其中苯丙氨酸含量明显高于其他游离氨基酸，同时苦味氨基酸会促进其他游离氨基酸呈现出较好的鲜味和甜味[28]。半胱氨酸、赖氨酸和酪氨酸属于无味氨基酸，故对酶解液风味无影响。徐欣如等[29]研究发现，复合蛋白酶+复合风味蛋白酶组合酶解所得牛骨素酶解液鲜味氨基酸含量最高，制备出的香精味感圆润、柔和，是最佳的组合酶，本研究与其结果一致。

2.4 酶种类对复合骨素酶解液呈味核苷酸含量的影响

5-核苷酸是核苷酸中主要的呈鲜味物质，也是引起酶解产物风味差异的重要原因，从而有助于提升肉质鲜味[30]。对3 种5-核苷酸（5-IMP、5-GMP和5-AMP）含量进行测定，由表4可知，复合骨素酶解液总核苷酸含量为13.08～15.08 mg/100 mL，其中5-IMP含量明显高于5-GMP和5-AMP含量，这是由于5-IMP主要存在于动物源食品中，5-GMP则是植物源食品中的主要呈鲜味物质，而5-AMP是5-ATP的降解产物，故含量较低[31]。不同酶处理组复合骨素酶解液的核苷酸含量一般遵循水解度越大，含量越高的规律，B组的水解度最低，但是总核苷酸含量最高，P+F组的总核苷酸含量仅次于B组，可能是由蛋白酶的作用方式和酶切位点特异性造成的，因此不同酶之间存在一定差异性，后续酶解液产生的风味也会有所不同[32]。

3 结 论

研究复合蛋白酶（P）、菠萝蛋白酶（B）、复合风味蛋白酶（F）、复合蛋白酶+复合风味蛋白酶（P+F）、菠萝蛋白酶+复合风味蛋白酶（B+F）及复合蛋白酶+菠萝蛋白酶+复合风味蛋白酶（P+B+F）6 组酶对复合骨素酶解液呈味物质的影响。结果表明：P+F组复合骨素酶解液的水解度最大，达11.27%;酶解液中小分子质量肽（<200 Da）分布比例最大，且P+F组高于其他处理组;P+F组酶解液的游离氨基酸总含量最高，鲜味和甜味氨基酸是复合骨素酶解液的主要呈味成分;P+F组的5′-核苷酸（5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP）总含量较高，仅次于B组。因此，复合蛋白酶和复合风味蛋白酶组合可以增强复合骨素酶解液的鲜味和醇厚感，改善酶解产物的整体风味，为研发复合骨衍生产品调味料基料提供理论参考。

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