一株产蓝色素放线菌筛选鉴定与性质初探

刘晓飞，郑志辉，宋洁，刘美茜，关桦楠，张娜，王薇

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150076)

色素又被称为色阶、着色剂等，是食品添加剂的重要组成部分[1]。食品的颜色对吸引消费者和评价产品质量起着重要的作用[2]。色素可以增加食品的色泽、延长食品的贮藏时间，是决定食品质量的重要因素之一[3,4]。色素分为天然色素和合成色素。近年来的研究表明合成色素有毒性，进入人体后会使染色体断裂，使细胞死亡并失去输氧能力[5]，而天然色素因安全可靠、无毒副作用且可提供营养而被人们广泛关注。天然色素可从各种植物、动物、微生物等中提取。微生物色素的生产具有来源广、成本低、产量高等优点。放线菌是色素的主要来源，放线菌色素包括放线紫素、石蕊杀菌素和花青素等[6-8]，其色素多用作抗生素、营养剂和食品保护剂[9]，还可用作抑菌剂及多种食品的着色剂等[10]。因此，放线菌产生的色素对食品行业具有重要的作用和意义。

土壤是放线菌筛选的重要来源，不同的、独特的地容地貌为新型放线菌的筛选提供了更多的选择。Gan Renyou 等[11]从食用豆皮的提取物中发现了原花青素，且原花青素表现出高抗菌和抗氧化作用。Domenico Carminati等[12]在芝士工厂筛选到了产蓝色素的假单胞菌并且以此为指标控制奶酪变质。Selvakumar Dharmaraj等[13]从白花海绵状愈伤组织中分离到白色系链霉菌(AQBWWS1)，经荧光白光发酵后产生食品级色素(类胡萝卜素)。本实验从东北寒地黑土中分离筛选出产色素的放线菌，探索了寒地黑土的微生物菌种及其代谢产物，获取了一种有应用价值的代谢产物，根据培养和形态学特征对其进行了放线菌菌株的鉴定，并对色素的性质做出探究，为此放线菌色素的使用条件提供了参考，为天然色素的开发应用拓宽了领域。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 土样来源

黑龙江省牡丹江市(东经128°02′～131°18′、北纬43°24′～45°59′)。

1.1.2 培养基

高氏1号液体培养基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸钾1.0 g，磷酸氢二钾0.8 g，氯化钠0.8 g，硫酸镁0.8 g，硫酸亚铁0.05 g。

高氏1号固体培养基：可溶性淀粉20.0 g，硝酸钾1.0 g，磷酸氢二钾0.8 g，氯化钠0.8 g，硫酸镁0.8 g，硫酸亚铁0.05 g，琼脂粉20.0 g。

燕麦汁琼脂(ISP3)固体培养基：燕麦片20.0 g，硝酸钾1.0 g，磷酸氢二钾0.8 g，氯化钠0.8 g，琼脂粉20.0 g。

指示菌培养基LB：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂5 g。

1.1.3 实验仪器

BS-224-S电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；SW-CJ-1FD单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器、KQ-250DE台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SHB-IV分光光度仪 郑州长城科工贸有限公司；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱 上海申安医疗器械厂；DHP-9162电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；KQ-250DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 菌种筛选

将土样晾干后取5 g，将其研磨后加入无菌水制成悬液，放入摇床于28 ℃、180 r/min振荡1 h后将悬液过滤后得到原液，将原液依次稀释至10-5，选取浓度为10-3、10-4和10-5的稀释液涂布在高氏1号固体培养基上并在28 ℃下进行培养。

15 d后将平板中的放线菌挑出并将其接种到燕麦培养基上，若没有单一菌落可再次传代，直到得到单一菌落，命名为GS-1。

1.3 菌种鉴定

1.3.1 形态特征观察和染色

将菌株GS-1接种于ISP3固体培养基上，28 ℃下恒温培养3～4 d后，观察菌落大小、颜色、边缘状况。

将菌株GS-1接种于GY液体培养基中，28 ℃、180 r/min下恒温振荡培养3～4 d，取菌液置于载玻片上，固定后用番红染色，观察菌丝形态。

1.3.2 分子生物学鉴定

液体培养：用接种铲从长满孢子的斜面培养基上刮取GS-1菌落，并将其接种在GY液体培养基中，180 r/min、28 ℃恒温振荡培养3～4 d。

分子生物学鉴定：参考李小霞等[14]采用的DNA提取、PCR扩增和电泳实验方法。

建树：通过MEGA 6.06软件中的邻近连接方法构建系统发育树，最后通过比较获得的序列，通过邻接法(NJ)构建系统发育树[15]。

1.4 色素提取

1.4.1 SDS提取法

称取2 g的SDS溶于100 mL水中配制成2%的SDS，调节pH至12待用；取10 mL发酵液，加入浓度为2%的SDS(pH 12)，50 ℃下搅拌25 min后以5000 r/min离心20 min。重复上述操作，直至沉淀发白，吸取上清液测定波长259 nm下的OD值。

1.4.2 碱提取法

取10 mL发酵液，将pH调至9，以5000 r/min离心20 min，取上清，于波长259 nm下测OD值。

1.4.3 超声提取法

取10 mL发酵液，置于100%功率的超声波清洗机中，在50 ℃下超声处理20 min，以5000 r/min离心20 min，取上清，于波长259 nm下测OD值。

1.4.4 蓝色素的提取得率

蓝色素提取产率定义为通过每种方法提取的色素溶液测量的OD值与通过SDS提取方法提取的色素溶液测量的OD值之间的比率。

1.5 色素性质研究

1.5.1 蓝色素紫外-可见吸收光谱扫描

取GS-1所产的蓝色素配成溶液，在200～700 nm下扫描UV-可见吸收光谱。

1.5.2 溶解性实验

吸收相同量的样品溶液，加入水、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中，并与10 mL各溶剂充分混合以观察溶解情况。

1.5.3 抑菌性实验

使用牛津杯法测定蓝色素对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(白葡萄球菌)的抑制作用。

1.5.4 稳定性实验

1.5.4.1 pH对蓝色素稳定性的影响

各取10 mL稀释的原液，分装在5个100 mL Erlenmeyer烧瓶中，将稀释原液的pH值分别调至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，将在室温下避光储存的稀释储备溶液用作空白对照，并在259 nm下测其OD值。

1.5.4.2 直射光照射时间对蓝色素稳定性的影响

取50 mL稀释原液，置于日光下照射10 h (9∶30-19∶30)，每隔2 h取样10 mL，将在室温下避光储存的稀释储备溶液用作空白对照，并在259 nm下测其OD值。

1.5.4.3 紫外线照射时间对蓝色素稳定性的影响

取50 mL稀释原液，置于无菌操作台上T以紫外光照射10 h，每隔2 h取样10 mL，将在室温下避光储存的稀释储备溶液用作空白对照，并在259 nm下测其OD值。

1.5.4.4 NaCl浓度对蓝色素稳定性的影响

取50 mL稀释原液，分装在5个小试管中，每个10 mL。分别向试管中加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的NaCl溶液，将在室温下避光储存的稀释储备溶液用作空白对照，并在259 nm下测其OD值。

1.5.4.5 金属离子对蓝色素稳定性的影响

取50 mL稀释原液，分装向5个小试管中，每个10 mL。分别向试管中加入1 mol/L的NaCl溶液、KCl溶液、MgCl2溶液、CaCl2溶液、BaCl2溶液，将在室温下避光储存的稀释储备溶液用作空白对照，并在259 nm下测其OD值。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选结果

在ISP3固体培养基上菌株GS-1的菌落形态见图1～图3，番红染色的镜检结果见图4。

图1 GS-1菌落形态(正)Fig.1 GS-1 colony morphology (obverse)

图2 GS-1菌落形态(反)Fig.2 GS-1 colony morphology (reverse)

图3 GS-1单菌落Fig.3 GS-1 single colony

图4 GS-1镜检Fig.4 GS -1 microscopy

菌株GS-1的放射状灰色菌丝向四周匍匐生长，菌丝较稀疏，气生菌丝较少，菌丝层较薄，菌落呈规则圆形，因菌丝生长速度不同，边缘不齐；孢子为灰色，由中心向四周蔓延，其密度分布呈明显的波浪带状，整体孢子密度大；中间有气生菌丝微微向上凸起，基内菌丝呈蓝色，产生蓝色色素。

番红染色后镜检可见菌株GS-1的菌丝呈明显的丝状，与基内菌丝相比气生菌丝更粗。

2.2 分子生物学鉴定结果

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳见图5。PCR扩增后的产物经凝胶回收后，将质粒送去测序，获得GS-1的16S rRNA序列，共1589 bp，菌株GS-1的系统发育树见图6。

图5 琼脂糖凝胶电泳结果Fig.5 Results of agarose gel electrophoresis

图6 基于16S rRNA和相关菌株的菌株GS-1的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain GS-1 based on 16S rRNA and related strains

注：分支处仅显示出>50%的靴值，0.001代表两个核苷的遗传距离。

与菌株GS-1高度同源的菌株为链霉菌，同源性最高的菌株为Streptomycestauricus(AB045879)，同源率达99.93%。选取同源性>98%的相关菌株，通过MEGA 6.06软件中邻近连接法构建系统发育树(见图6)，并分析其进化关系。结果表明：在构建的系统发育树中，菌株GS-1与Streptomycestauricus形成单一且稳定的分支，靴值为67%，其被确定为链霉菌属。

2.3 蓝色素紫外-可见吸收光谱扫描

蓝色素在200～700 nm处紫外-可见吸收光谱扫描结果见图7。

图7 蓝色素紫外-可见吸收光谱扫描Fig.7 UV-visible absorption spectrum scanning of blue element

由GS-1所产蓝色素最大吸收波长为259 nm，此时的最大吸收峰为1.6519。

通过各提取方法测得的OD值与蓝色素提取得率见表1。

表1 蓝色素提取得率表Table 1 Extraction rates of blue pigment

由表1可知，SDS提取法对该蓝色素的提取效果最好，碱提取法其次，提取得率为60.2%，超声提取法效果相对较差，提取得率为50.4%。

2.4 色素性质研究

2.4.1 溶解性实验结果

相同量的色素在不同溶剂中的溶解情况见表2。

表2 不同溶剂中色素的溶解情况Table 2 Dissolution situation of pigment in different solvents

由表2可知，链霉菌GS-1所产蓝色素易溶于水，而不易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，为水溶性色素。

2.4.2 抑菌性实验

蓝色素对大肠杆菌和白葡萄球菌的抑菌效果见表3。

表3 色素抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effect of pigment

2.4.3 稳定性实验

2.4.3.1 pH对蓝色素稳定性的影响

pH对蓝色素稳定性的影响见图8。

以该色素溶液的原液作对比，当溶液的pH为2.0～6.0时，色素相对稳定，在样品的pH超过8.0时，样品的OD值显著升高。在不同的pH条件下色素有不同的颜色，当样品溶液的pH为酸性时，溶液颜色为粉红色；当样品溶液的pH为碱性时，溶液颜色为蓝色，且pH越高蓝色越深，与李一苇等的实验结果基本一致[16]。

2.4.3.2 光照时间对蓝色素稳定性的影响

直接光照时间对蓝色素稳定性的影响见图9。

图9 直射光光照时间对蓝色素稳定性的影响Fig.9 Effect of direct light duration on stability of blue pigment

以该色素溶液的原液作对比，随着直射光光照时间的增长，样品的OD值显著降低。直射光光照时间在2～6 h(9∶30-15∶30)内，样品的OD值随着时间增长而变小；在第8 h(15∶30-17∶30)时，色素的OD值上升；在第8～10 h(17∶30-19∶30)时，样品的OD值下降。 此结果与吴恒[17]的实验结果差距较大，可能是因为设置测定的时间间隔不同。

2.4.3.3 紫外光光照时间对蓝色素稳定性的影响

紫外光光照时间对蓝色素稳定性的影响见图10。

图10 紫外光光照时间对蓝色素稳定性的影响Fig.10 Effect of ultraviolet light duration on stability of blue pigment

以该色素溶液的原液作对比，色素在紫外光下光照时间越长，稳定性越差，与吴恒的实验结果基本一致。该色素储存时应小心储藏，以避免暴露在紫外线下。

2.4.3.4 NaCl浓度对蓝色素稳定性的影响

NaCl浓度对蓝色素稳定性的影响见图11。

图11 NaCl浓度对蓝色素稳定性的影响Fig.11 Effect of NaCl concentration on stability of blue pigment

以该色素溶液的原液作对比，该样品在有Na+存在的情况下稳定性较差，NaCl浓度为0.4 mol/L时，色素的OD值最大。本实验结果说明Na+有一定的增色作用。

2.4.3.5 金属离子对蓝色素稳定性的影响

金属离子对蓝色素稳定性的影响见图12。

图12 金属离子对蓝色素稳定性的影响Fig.12 Effect of metal ions on stability of blue pigment

以该色素溶液的原液作对比，样品在5种金属离子影响下OD值均有所升高，Ba2+对色素溶液的OD值有很大影响，而其他4种离子对样品溶液的影响较小，与韦瑶等的研究结果基本一致[18]。加入Ba2+后，由于络合物的形成，色素溶液较浑浊，因此在使用此色素时，应尽可能避免其与Ba2+接触。

3 结论与讨论

天然色素在食品方面不仅可以作为增色剂，还可以作为食品的包装材料，具有非常大的应用价值。我国目前食品中允许使用的蓝色素只有两种，即栀子蓝色素和藻蓝色素，因此，蓝色素的开发和使用就显得尤为重要。Zhu Yunping等从链霉菌A1013Y中分离到一种新型蓝色素，纯化后组分为4,8,13-三羟基-6,11-二氢-三氢花青素A(TDTA)，此种色素可有效清除人体自由基[19]。边名鸿等[20]从类芽孢杆菌XF-105中提取了红色素并对其稳定性进行了探究，发现该红色素溶于乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等，微溶于水，不溶于正丁醇；pH、温度、氧化剂、还原剂及常用食品添加剂等对该色素的稳定性影响较小，光照对色素稳定性影响显著；Mg2+、K+、Na+对红色素稳定性基本没有影响，Mn2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+等金属离子对红色素都有不同程度的消色作用。

天然的蓝色素具有很强的抑菌作用，在食品保藏方面具有很大前景。根据寒地黑土的特殊生态环境，分离筛选出一株产蓝色素的放线菌，对其进行形态、培养特征及分子生物学鉴定并通过构建发育树将该菌株GS-1确定为链霉菌属，并制备了微生物的代谢产物。本研究所获得的蓝色素在酸性条件下为粉红色，在碱性条件下蓝色素颜色加深；当溶液中存在NaCl时，它是稳定的，当NaCl的浓度为0.4 mol/L时，对色素有明显的增色作用；当Na+、K+、Ca2+、Mg2+存在时，对色素影响较小，若Ba2+存在，则色素溶液变浑浊。该色素对大肠杆菌和白葡萄球菌均有抑制作用，避光稳定性较强，该菌株具有进一步研究的价值。