光化学法诱导兔视网膜分支静脉阻塞模型的初步探讨

张佳良，桑子瑾，吴烈，吴文婷，张婷婷，张亿

视网膜静脉阻塞(retinal vein occlusion，RVO) 是第二大致盲性眼底血管性疾病，其中视网膜分支静脉阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)约占5/6，且其发病率仍在逐年增加［1］。由于BRVO 具体发病机制尚不明确，病程冗长，并发症较多，严重影响视力，目前尚无有效治疗方法[2]。通过建立合理的BRVO动物模型，对BRVO 的探索研究具有重要意义。目前建立实验性BRVO 的模型有多种，不同实验目的采用的方法和技术参数也不同，其中应用光化学法诱导该模型的研究较多，但技术操作未形成统一的标准化方案。为进一步完善操作技术，采用以荧光素钠为光敏剂的光化学方法建立的新西兰兔实验性BRVO 模型，取得较满意的结果，该造模方法操作简单，眼底观察方便，病理改变与临床BRVO 相似，并通过对造模后连续观测与单点观测的结果比较，来验证多次实验外部干预是否会对模型病变及病程产生影响，为后期RVO 治疗的相关实验研究筛选出更好的造模方案，现总结介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择健康成年清洁级新西兰兔40只（中国中医科学院广安门医院实验动物中心提供，许可证号SCXK（京）2014-0012），体重2.5～3.0 kg，兔龄12～16 个月，无眼疾患，雌雄兼用。动物实验符合空军军医大学动物伦理委员会标准。

1.1.2 主要试剂 戊巴比妥钠（美国Sigma 公司）；荧光素钠注射液（广州白云山明兴制药有限公司）；复方托吡卡胺滴眼液（北京双鹤现代医药技术有限公司）；多聚甲醛（上海源聚生物科技有限公司）。

1.1.3 主要设备VISULAS 532s（德国ZEISS 公司）；光学相干断层扫描仪（日本Topcon 公司）；眼底荧光血管造影仪（fluorescein fundus angiography，FFA）（德国Heidelberg 公司）；Olympus BX51 光学显微镜（日本OLMPUS 公司）。

1.2 动物分组

按照动物编号随机分组，雌雄各半，第1组：8只，用于3、7、14 和21 d 的持续FFA 检测；第2组：24 只，每个时间点6 只，分别于3、7、14 和21 d 不同时间点观测FFA；第3组：8 只，不造模作为正常对照组。最后分别在7、14、21 和28 d 摘除兔眼球做病理切片。

1.3 模型建立

将实验兔适应性喂养3 d 后造模，用复方托吡卡胺滴眼液点右眼散瞳至瞳孔直径约5～6 mm，盐酸利多卡因表面麻醉，按1 ml/kg 的剂量头皮针经兔耳缘静脉注入3%的戊巴比妥溶液麻醉并留置头皮针，将实验兔固定置于激光机前，放置三面镜观察眼底，经耳缘静脉注射10%荧光素钠注射液（0.3 ml/kg），找出与视网膜动脉相伴行的静脉，应用532 激光，波长530 nm，能量100～300 mW，光斑直径100～300 μm，持续时间0.2～0.5 s，光凝点选在距离视盘0.5 DD（视盘直径长度）外的分支静脉处。先以较小光斑小能量光凝静脉选定点的远端，然后光凝静脉选定点的近端，见静脉收缩局部变白血流中断后，再以较大光斑大能量光凝两点中央区，形成一段约1/3 DD 的静脉血栓区域。每只实验兔光凝右眼，根据需要分别光凝一侧或两侧分支静脉，每支静脉平均光凝约30 点，同时避开伴行的动脉。

1.4 眼底影像学检查

1.4.1 眼底彩色照相 实验兔经激光光凝后，在静脉麻醉状态下置于OCT 仪前方固定好，以视盘为中心，找好角度进行拍摄。

1.4.2 FFA 检查 激光光凝后即刻或在3、7、14、21 d不同观测时间点，将静脉麻醉状态下的实验兔置于造影机前，自兔耳缘静脉快速注入10%荧光素钠注射液（0.1 ml/kg），调整焦距和亮度，待荧光素钠循环至眼底，以视盘和激光光凝点为中心进行荧光素钠血管造影检查，观察眼底视网膜静脉阻塞、侧支循环建立以及损伤血管再通情况[3-4]。

1.5 组织病理学

造模后分别在7、14、21 和28 d 四个时间点，将实验兔用空气栓塞法处死，摘除眼球，10%福尔马林溶液固定，眼球壁石蜡包埋切片，每个时间点选取临近光凝部位的6 张切片，HE 常规染色，光学显微镜下观察视网膜结构变化，同时每张切片在400 倍光学显微镜下随机选取5 个不同视野，统计神经节细胞的密度及外核层细胞层数的变化情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间的两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜眼底观察

激光光凝视网膜静脉分支时，可见血流逐渐变慢至单个红细胞通过光凝变窄处，随后血流停止，静脉阻塞形成；造模后在接触镜和检眼镜下均可见光凝点远端静脉扩张、迂曲、颜色加深，相应区域出现轻度灰白色混浊、水肿，有些兔阻塞静脉的周围有小片状出血。

眼底照相：光凝血管收缩变细，血柱变窄甚至消失，光凝静脉呈腊肠样节段状闭锁，毗邻视网膜呈灰白色水肿或见散在出血，受阻静脉直至终末小静脉明显迂曲扩张，阻塞区供应动脉痉挛性收缩变细（图1）。

图1 实验兔光凝后彩色眼底照相。可见光凝处静脉血流阻断（黑箭头所示）远端血管扩张，毗邻视网膜呈灰白色水肿，周围可见散在出血点

2.2 FFA 检查

模型组荧光素钠注入后约5 s 时视网膜静脉内荧光素开始充盈，激光光凝的静脉荧光素充盈缓慢，光凝点有荧光渗漏，远端静脉扩张、迂曲，近端无荧光素充盈。FFA 图片可见造模眼出现荧光遮蔽现象，以及光凝的静脉周围存在多少不等的荧光素渗漏（图2）。

不同时间点各组造模后FFA 结果示：连续观测组中，3 d 时FFA 显示有荧光遮蔽和渗漏现象，光凝处局部无灌注；7 d 时光凝处血管变迂曲，渗漏区缩小；14 d 时血管仍为迂曲状，但回流开始增加，损伤部位血管有荧光素着染，远端血管缓慢充盈；21 d 时血管完全再通，但血管仍明显迂曲扩张；单个时间点观测组的动物模型，3 d 与7 d 时与连续观测组模型表现情况大致相同；14 d 时部分动物仍有静脉充盈缓慢延后，血管迂曲变细现象，说明BRVO 模型维持稳定；21 d 时光凝血管发生再通，可见血管有迂曲变细的形态变化。因此，两个观测分组FFA 的比较结果显示：两组动物均造模成功，光凝血管阻塞程度表现大致相同，并且模型维持时间及血管再通时间也基本一致（图2）。

图2 FFA 检测兔视网膜血管血流情况。2A 正常兔视网膜血管血流通常，荧光素均匀充盈；2B 造模后即时检测光凝静脉周围出现荧光素渗漏；2C 造模后3 d 光凝点处有荧光素渗漏，渗漏区较前缩小；2D 造模后7d 血管迂曲变细，静脉损伤部荧光素呈点状渗漏；2E 造模后14d 血管仍为迂曲状，损伤静脉有荧光素着染；2F 造模后21 d 血管再通仍为迂曲形态，有侧支循环建立

2.3 视网膜组织病理学

图3 模型兔视网膜组织HE 染色（×400）。3A 正常兔视网膜组织各层组织排列较整齐；3B 造模后7 d 可见视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核及外核层水肿增厚；3C 造模后14 d 外核层细胞相对减少，剩3～4 层细胞；3D、3E 造模后21 d、28 d 视网膜基本恢复正常；3F 模型兔视网膜血管中可见血小板与红细胞结合成的血栓组织，血管管壁完整

造模后实验兔视网膜整体结构较紊乱，7 d 时神经节细胞层、内丛状层严重水肿，内核层和外核层也有轻度水肿；14 d 时神经节细胞明显减少，外核层相对变薄；21 d 与28 d 视网膜结构逐渐恢复正常。部分血管可见少量血栓及纤维组织（图3）。统计各时间点实验兔视网膜神经节细胞数量与外核层细胞层数，发现在14 d 时模型兔视网膜神经节细胞数（2.83±1.17） 明显少于正常兔视网膜神经节细胞数（12.33±8.07）个，t=2.480，P=0.020，有统计学意义。其他时间点基本同正常组；14 d 时模型兔外核层细胞（4.00±1.27） 层少于正常对照组外核层细胞层数（5.83±0.75）层，t=4.166，P=0.000，有统计学意义（图4），其他时间点较正常组无统计学意义（P＞0.05）。

图4 兔视网膜组织中神经节细胞数与外核层细胞层数变化。4A 视网膜神经节细胞数（RGC/个）对比图；4B 视网膜外核层细胞层数（层）对比图

3 讨论

视网膜静脉阻塞模型目前最常用的动物有大鼠、有色兔与白兔等，大鼠由于眼球小，视网膜血管细，造成了光凝造模的技术难度；并有报道称光凝后SD 大鼠死亡率高，约为20%～30%，眼球局部急性反应耐受不良，可能与光凝所致的疼痛导致的心律失常有关；光凝血管再通时间约为3～5 d[3]，模型稳定性差；兔子因实验成本低，眼球较大，视网膜动、静脉血管利于观察，在RVO 研究中被大多数学者选为模型动物，但兔眼的解剖结构与人类有较大差异，尤其两侧视网膜静脉走行与人体眼不一样为直行，并不汇聚成静脉血管弓，动静脉之间存在广泛的动静脉交叉，并且在视网膜和脉络膜之间存在一些毛细血管，因此这些解剖学差异使我们无法创造出与人类完全一致的BRVO 模型；当前研究表明，色素含量不同的视网膜在接受光化学法造模后，实验结果存在一定程度的差异，在眼底观察方面，有色兔的RPE 层可见明显的色素颗粒，故有色兔将更有利于对病程的掌握和观察[5]。但目前使用白兔造模仍然较为普遍。

建立视网膜静脉阻塞模型的方法有多种：光化学法、直接激光光凝法、光动力诱导法、血管结扎、冷凝、凝血酶静脉滴注法、玻璃体内注入内皮素-1 等[6]。其中直接激光光凝法及光动力诱导法由于临床效应和精准度问题应用减少，而外科手术及凝血酶、内皮素注射法由于造模成功率低未得到广泛应用[7]。1987年，Nanda 等[8]首先利用氙光灯激光加孟加拉红成功制作兔BRVO 模型，这种方法被称为光化学法，其原理是利用激光激发光敏剂后产生的热效应阻塞血管[9]。本实验中将荧光素钠作为光敏物质，它的激发光波长范围为530～570 nm，本次实验使用的波长530 nm 正好将其激光吸收优势发挥到最佳。荧光素钠注射后约有60%可与血红蛋白结合，在造模过程中发挥了与孟加拉红相同的功效，吸收光能后产生单态氧，可使脂质、蛋白质和细胞核酸过氧化，使细胞损伤。脂质过氧化造成血管内皮细胞损伤，激发血小板黏附和凝集，从而启动凝血系统，导致血栓形成，因此光化学法建立的BRVO 模型，其血栓形成机制与临床较相似[10-11]。然而，光化学法也有一定的缺点与局限性，例如临床上激光作为BRVO 的一种常见治疗方法，因此其作为造模方法并不能排除激光本身的治疗作用[12]。同时由于激光的热效应会导致光凝部位视网膜外核层的细胞损伤或凋亡，而影响实验结果。再者，荧光素钠等常见光敏剂极敏感，非常容易导致光凝的静脉破裂出血，造成严重的玻璃体积血进而影响实验观察，因此，应根据实验动物本身的耐受性与敏感性选取合适的质量浓度与注射剂量。最后，激光操作人员的激光技术和稳定性以及辅助人员的稳定性均会影响造模结果，因此，对团队的配合和协作有较高要求。总之，与以上其它方法相比，光化学法具有造模方法简单，可批量制作，模型重复性好，成功率高，损伤精确可视化等优点，并且光化学法建立的RVO 模型，其血栓形成机制与临床更相似，所以光化学法用于建立BRVO 模型被广泛认可。随着激光技术的进步与光敏制剂研究的深入，光化学法造模操作技术不断改进，文献中成功的新西兰白兔RVO 模型的技术参数：光敏剂多选用孟加拉红和荧光素钠；倍频532 型激光机，采用二极管激发式固态激光，波长为532 nm，能量设定为100～130 mW，光斑直径对应75 μm，持续时间0.2 s，照射点为10～18点[11]；还有能量设定为400 mW，光斑直径为100 μm，持续时间为0.2 s，光凝点数为30 点[13]；倍频ND：YAG激光机，采用氪-绿激光，波长为530 nm，能量设定为300 mW，光斑直径为100 μm，持续时间0.2 s，光凝点数为60 点[4]等。不同的激光类型，具体参数也不同，需要在实验中调整，但结果均显示造模成功。

关于光化学法制备BRVO 动物模型的报道很多，但一直以来没有标准的造模参数，本实验成功建立了视网膜分支静脉阻塞的模型，现将该模型的优缺点总结如下，优点是，（1）实验动物的选择：新西兰白兔成本较低，眼球较大，可在眼底镜下直接动态观察视网膜微循环的确切变化。虽然兔眼视网膜血管走行于视网膜有髓神经纤维中，但不影响实验观察和操作[14]。（2）光凝血管大小和位置的选择：选择两侧视网膜静脉距离视盘0.5 DD 的分支静脉处，此处血管清晰且粗细得当，根据实验兔个体解剖结构差异，光凝1～2 根分支静脉，既保证了光凝过程中稳定性问题，同时又能保证造模成功率。（3）光凝方法和光凝点数量的选择：采用节段性光凝，先光凝选定部位的两端，见静脉收缩后再光凝中央，最终形成一段约1/3 DD 的静脉阻塞区域，既避免光凝单点位置造成血管破裂出血，以及易损伤血管周围视网膜等问题，又能通过增大血管阻塞部位及程度，有效地延长模型维持时间，提高造模成功率。（4）动物分组：本实验动物分为连续观测组与单个时间点观测组，得出的结果更丰富，减少了动物个体差异的影响；同时能进行不同时间点的病理学研究。从观察结果看，14 d为本实验的时间节点暨最可靠的静脉血管阻塞维持时间点，为后期研究提供了基础。（5）光敏剂的选择：荧光素钠与孟加拉红相比，其不与组织牢固结合，不参与机体代谢，大部分经肾脏随尿液排出，毒性小，更安全[15]；同时可减少实验兔耳缘静脉炎的发生。（6）临床符合性：临床中视网膜分支静脉阻塞患者多合并高血压病、糖尿病、高脂血症等疾病，并且这些疾病本身作为BRVO 的危险因素，参与了其发病过程，因此建立合并相关疾病的光化学兔BRVO 模型，更能接近临床实践。实验中的问题与不足：（1）由于白兔眼底视盘界限模糊，颜色较暗，眼底彩照无法拍摄满意的效果，今后应注意选用适合实验动物眼底彩照的专业仪器；（2）由于预实验中单纯激光光凝血管再通快，模型难以维持，故优化造模方法加用荧光素钠光敏剂，在后期实验中可设置激光光凝组作为对照以使实验设计更完整；（3） 目前的BRVO 模型还不能完全模拟人类视网膜静脉阻塞的发病机制及病理改变，研究者应根据研究目的选择不同的BRVO 模型才能保证研究的科学性[16]。

综上所述，通过选择合适的实验动物，恰当的激光类型、能量和光凝时间，合理的光凝位置，比较适宜的光敏剂等，可以成功模拟BRVO 的临床病理过程，成功建立新西兰兔BRVO 模型，该造模方法切实可行、重复性好、成功率高。可依据实验目的改进细节以期模拟出更长期稳定、更符合临床实际的BRVO 模型。