新型冠状病毒IgG/IgM抗体双重检测免疫层析方法的建立研究

孙 永,何 军,蔡 芬,姚 丽,陈晴晴, 陈奉玲,汪 梦,陈 伟

(1.安徽省疾病预防控制中心,安徽 合肥 230601; 2.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

自2019年12月至今,中国湖北省陆续出现原因不明的肺炎病例[1-2]。截至2020年3月24日,中国累计确诊病例81 218例,死亡3 281例[3]。在海外其他国家(包括韩国、日本、伊朗、新加坡、意大利,是排名前5位的国家)中,累计确诊病例也有2 309例,其中33例死亡。2020年1月7日,中国疾病预防控制中心将该病原确定为新型冠状病毒,并命名为“ 2019-nCoV”,属于“ SARS-COV-2”; 2020年1月12日,世界卫生组织正式将造成这次疫情的新型冠状病毒命名为“2019-nCoV”;2020年2月11日,又将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”。经过初步流行病学调查确定武汉的华南海鲜市场为事件的最初爆发地点[4]。

我国相继出台的新型冠状病毒诊疗方案[5]中说明该病毒属于β属冠状病毒,感染会导致肺部炎症。其中,呼吸道飞沫传播和接触传播是主要传播途径,而气溶胶等其他传播方式尚待确诊。临床诊断病例或疑似病例经实时荧光反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测血液标本或呼吸道标本核酸阳性或者其病毒序列与新型冠状病毒高度同源2个病原学诊断满足其一者即为确诊病例。因此,当前,对于新型冠状病毒的快速确诊主要依赖于实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的结果。但是,在不断的临床检验过程中发现,样本的采集方法是否标准,送检过程是否严格执行以及试剂盒本身性能的局限性,都会影响到样本的质量,最终会影响到核酸检测结果,从而导致假阴性检测结果,严重影响疫情的有效控制。有报道发现,RT-PCR对咽拭子标本的总阳性率为30%～60%[6],其敏感性较低。在当前的状况下,这意味着许多患者可能无法被确诊,从而失去最佳的治疗时机。目前也发现很多最初的RT-PCR结果阴性的患者中胸部CT发现与COVID-19一致的肺部病变[7-8],说明该方法仍需要改进。

当新型冠状病毒入侵并感染人体后,人体的机体受到外界刺激后,会激活人体的免疫系统,产生具有保护作用的蛋白抗体IgG和IgM。基于IgG和IgM的诊断指标已经被归入新型冠状病毒肺炎(简称“新冠肺炎”)治疗计划(试行第7版),实现对核酸检测的有效补充,通过联合诊断的方法,实现对新冠肺炎诊断准确率不断提高的目的。

胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatographic assay, GICA)是20世纪末发展的一种利用胶体金纳米粒子作为标志物，并结合免疫识别技术和层析技术的一种现场、快速检测的方法。其基本原理是利用抗原抗体的特异性识别作用,导致胶体金在侧向层析试纸条上进行显色判断检测结果。根据胶体金显色强度可以实现信号强弱的快速判断，是一种新型免疫标记技术。利用侧向层析试纸条技术,已经实现了快速测定水中汞离子[9-10]、以及通过信号放大实现超敏检测水中双酚A[11]等。总体来讲,利用该技术能很大程度上缩短检测时间并兼具准确性,可以在基层早期病情诊断中发挥有效作用。本研究将胶体金纳米粒子作为标记物,对新型冠状病毒的重组抗原进行标记,利用重组抗原和单克隆抗体对目标新冠肺炎抗体IgG和IgM同时检测,基于IgG和IgM的联合检测结果,实现了对新冠肺炎感染的快速筛查和判断,提高了新冠肺炎的诊断筛查效率和准确率。

1 主要试剂与仪器

1.1 主要试剂

HAuCl4、柠檬酸三钠、蔗糖、牛血清蛋白(BSA)、无水甲醇、酪蛋白(Casein)、人血清蛋白(HSA)、磷酸缓冲溶液(PB)、磷酸缓冲盐溶液(PBS),均购于国药集团化学试剂有限公司;抗人IgG抗体标准物质、抗人IgM抗体标准物质、重组抗原、羊抗鼠二抗,均购于北京拜尔迪科技生物有限公司;硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter,NC膜)、吸水垫、玻璃纤维膜、聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板以及相关试剂,均购于安徽深蓝医疗科技股份有限公司。

1.2 主要仪器

加热磁力搅拌器(广州仪柯实验室技术有限公司);电子天平(上海精力电子仪器有限公司);微型旋涡混合仪(上海芬波分析仪器厂有限公司);移液器(德国Eppendorf公司);电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司);低温高速离心机(德国贺力氏公司);试纸条喷膜仪(美国伯勒公司);试纸条切条机(美国伯勒公司)。

1.3 样本来源

确诊病例血清来自各市疾病预防控制中心;正常人末梢血样本为实验室人员自采;正常人血清为省疾病预防控制中心留存。

2 实验方法

2.1 胶体金的制备

本实验使用的胶体金为经典柠檬酸三钠还原法,利用柠檬酸三钠的强还原性将氯金酸还原为金。

具体操作步骤为:

(1) 向经过王水充分浸泡后并洗净的250 mL锥形瓶中加入50 mL双蒸水及850 μL氯金酸溶液(0.1 g/L),打开转子使其充分搅匀后打开磁力搅拌器热源使其加热到微沸。

(2) 当锥形瓶内液体状态变为微沸时,迅速向内打入850 μL质量浓度为10 g/L的柠檬酸三钠,一段时间后溶液将会发生明显的颜色变化,等到溶液颜色不再发生变化后关闭磁力搅拌器热源,并保持搅拌状态旋转5 min。

(3) 将制好的胶体金溶液置于室温冷却,待溶液冷却到室温时,将其放在2～4 ℃的条件下保存。通过调节实验参数可以得到不同粒径的胶体金。

2.2 胶体金与新冠病毒抗体重组抗原的偶联

取1 mL经上述步骤制备好的胶体金溶液于离心管,调节好合适的pH值再加入新冠病毒抗体重组抗原室温反应1 h后,加入适量体积封闭剂BSA封闭多余位点,封闭时长为0.5 h,待反应结束后使用15 000 r/min转速进行离心,取离心管下方沉淀,并用复溶剂BSA复溶到100 μL,并均匀滴加到处理好的标记垫上,放入27 ℃烘箱干燥。

2.3 胶体金试纸条的制备

试纸条的组成部分为吸水垫、玻璃纤维素膜、金标垫以及样品垫。首先将羊抗鼠二抗、抗人IgM抗体、抗人IgG抗体用PB(10 mol/L,pH值为 7.4)分别稀释至1 mg/mL,用喷膜仪包被在NC膜上,分别形成间隔5 mm的检测线1(test line 1,T1线)、检测线2(test line 2,T2线)和质控线(control line,C线),置于27 ℃烘箱中烘干2 h,取出置于4 ℃避光干燥保存。最后将划线胶板、金标垫、样品垫、吸水纸按照合适大小尺寸粘贴在PVC底板上,用切条机切割成3 mm宽的试纸条保存备用。

2.4 实验参数的优化

2.4.1 胶体金标记浓度的优化

本实验利用胶体金进行重组抗原的标记,从而在侧向层析试纸条上进行显色。胶体金浓缩的倍数对于最后试纸条上显色效果具有重要决定作用。对胶体金纳米粒子的溶液进行不同程度的浓缩,然后对重组抗原进行标记。验证不同浓缩倍数的胶体金标记后的检测效果,确定最佳的浓缩倍数。

2.4.2 检测缓冲体系的优化

胶体金侧向层析试纸条的检测体系对于侧向层析试纸条的特异性、灵敏度均具有明显的影响。选取常见的检测体系,利用制备好的胶体金试纸条,对阴性样品进行检测,从而确定最佳的缓冲检测体系。

2.4.3 试纸条特异性的检测

胶体金侧向层析试纸条的重要检测指标之一为特异性。通过所研制的胶体金侧向层析新冠IgG/IgM抗体快速筛查试纸条对确认阴性的血液样本进行检测,从而对试纸条的阴性准确率进行评价。

2.4.4 新冠病毒抗体IgG/IgM实际样品检测

基于上述优化后的胶体金侧向层析新冠IgG/IgM抗体快速筛查试纸条,对经过分子生物学确认阳性以及与新型冠状病毒感染患者密切接触者的血清进行检测,从而对所建立的胶体金侧向层析新冠病毒IgG/IgM抗体快速筛查试纸条的实际检测能力进行验证,并于核酸检测结果进行比对,对新冠抗体筛查试纸条的筛查准确性等指标进行探究。

3 结果与分析

3.1 新型冠状病毒试纸条的检测原理

人体被病毒感染后,免疫系统会自主由浆细胞分泌用来与外来物质中和的抗体。抗体可分为IgM、IgG、IgA、IgE、IgD共5类。IgM抗体是免疫应答中首先分泌的抗体, 是病毒感染自体免疫过程中最早出现的抗体,可作为近期感染的标志。IgG在人体内持续时间较长,IgG抗体阳性能表示感染时间较长或既往感染,是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。被新型冠状病毒感染后,人血液中也会产生类似的免疫反应和免疫抗体。通过对血液中新冠病毒免疫抗体IgG和IgM的检测,从而实现对新型冠状病毒感染的间接诊断,对基于核酸的分子生物学检测提供了有效的技术补充,为疫情控制提供重要的诊断依据。

以新型冠状病毒重组蛋白和免疫蛋白的抗体作为识别分子,同时识别血液中的IgG和IgM。胶体金试纸条结构如图1所示,在试纸条的金标垫上喷涂固定胶体金纳米粒子固定的新型冠状病毒重组蛋白复合物;在NC膜上用IgM单克隆抗体作为识别分子喷涂于NC膜上作为T1线; 用IgG单克隆抗体作为识别分子喷涂于NC膜上作为T2线;用羊抗属二抗作为识别分子喷涂于NC膜上作为C线。

当检测样品中存在IgG或IgM时,金纳米粒子表面的重组抗原能够与IgG或IgM结合,随着检测样品在NC膜上的迁移,继续分别与NC膜上T1或T2线上的IgM识别抗体结合,从而使胶体金试纸条上T1或T2检测线呈现肉眼可见的红色。

具体来讲,当检测样品中只有IgG时,只会引起试纸条上T2检测线呈现颜色;当检测样品中只存在IgM时,只会引起T1检测线呈现颜色;当检测样品中同时存在IgG和IgM时,会引起试纸条T1和T2检测线的同时显色。

不管样品中是否含有目标待测抗体IgG或IgM,质控线上的羊抗鼠二抗均会识别金标重组抗原,引起质控线C线的显色。若检测过程中C线没有呈现肉眼可分辨的红色,则表明此次测试的结果无效。

图1 新冠病毒胶体金试纸条结构

3.2 胶体金浓缩倍数的优化

本文利用不同浓缩倍数的胶体金纳米粒子对新型冠状病毒重组蛋白进行标记，其结果如图2所示。

从图2可以看出，随着胶体金纳米粒子浓缩倍数的增加,在试纸条上显色效果越好,颜色越有利于后期的肉眼观察和结果判断;随着浓缩倍数的增加(20、40倍)胶体金试纸条的显色强度越来越深,因此,选择40倍浓缩金作为最佳的标记条件。同时,对于IgM单一检测和IgM/IgG同时检测的结果进行了验证，结果表明，在阴性条件下，无论是IgM还是IgM/IgG的阴性血清和血液样本验证都满足实际检测的需要，没有交叉反应。

图2 胶体金浓缩倍数的优化结果

3.3 检测缓冲体系的选择

基于胶体金侧向层析试纸条所采用的检测溶液体系对于检测结果具有非常显著的影响。为了测试不同检测体系对于所建立的胶体金试纸条的检测结果的影响,本文采取5种检测体系进行验证阴性样本的检测结果，如图3所示,每组采取了2个平行样同时测试。

图3 检测缓冲体系的优化结果

从图3可以看出,除水作为检测体系的检测C线的较浅,其他几组缓冲体系都能够保证较好的检测结果。由于免疫识别作用需要在一定的离子强度下才能够较好地保证识别效果,因此,具有一定强度的缓冲体系才能够保证较好的检测结果。

考虑胶体金试纸条常规检测缓冲体系和实际验证结果,选取等渗PBS作为本文所建立IgG/IgM胶体金试纸条的反应和检测体系。

3.4 胶体金新冠病毒抗体IgG/IgM试纸条检测

利用条件优化后的新冠病毒抗体IgG/IgM胶体金试纸条,对实际的全血和血清样品进行检测。在检测阳性样本之前,先对正常人(阴性)的血液和血清样本进行了测试。为了进一步对检测结果进行比较,同时也对单一检测新冠IgM的胶体金试纸条进行了比较。利用本文所研究的新冠病毒抗体IgG/IgM胶体金试纸条对正常人血液和血清进行检测，结果如图4所示。从图4可以看出,试纸条上只有质控线C线显现肉眼分辨的颜色,检测线T1和T2均没有显色,表明正常人血液和血清直接检测的结果均为阴性,所研发的胶体金新冠抗体IgG/IgM试纸条对于阴性样本有较好的阴性检测准确性。

图4 阴性血液和血清样本检测结果

所有阴性样本检测结果的统计见表1所列。

表1 正常人全血及血清样品检测

从表1可以看出,共52例正常人血液样本进行了检测,其中51例为阴性结果,1例为弱阳性结果。阴性检测准确率为98.08%,满足实际筛查的需求。分析1例弱阳结果,测试者在检测前2周有通风经历,测试时恢复正常。表面通风症状可能引起了待测者体内应激反应,从而产生了免疫球蛋白等抗体。所产生的相应抗体在体内仍然有一定时间的周期,从而引起弱阳性。

进一步利用所构建的胶体金新冠病毒抗体IgG/IgM试纸条对新型冠状病毒阳性患者的血清进行检测。对于核酸确诊阳性病人的血清,试纸条能够对血清中的IgG和IgM实现快速检测，结果如图5所示。如58号阳性血清的检测结果,通过肉眼观察到3条线,表明其58号阳性血清中IgG和IgM的同时存在;同样,对于59号阳性血清,检测结果也是阳性结果。但仔细对比发现,59号样品中IgM的信号(T1检测线)要远高于IgG的信号(T2检测线)强度,表明该阳性血清中IgM是强阳性，而IgG是弱阳性。根据免疫抗体产生规律,在病毒感染的初期(3～7 d),在人体内产生的抗体为IgM,随着感染症状的发展,在感染的后末期(10 d以后),体内开始产生抗体IgG,且浓度越来越高直至最后慢慢衰减。

根据上述检测结果比较可以得出，59号阳性样本患者被新型冠状病毒感染的时间要短于58号阳性样本患者。此外,由图5所示的检测结果(如37号阳性样品)可知,IgG和IgM均显示弱阳性,其可能处于感染中期体内IgM开始衰减,IgM刚开始产生阶段;其他阳性样品(如26、28、29、30号)均显示单一指标(IgG或者IgM)阳性。

图5 阳性患者血清样本检测结果

从图5可以看出,患者被新冠病毒感染后,对体内免疫系统刺激所产生的保护性IgG和IgM抗体都能够被本文所提出的胶体金试纸条快速筛查出来。更重要的意义在于不同感染阶段的阳性样本也可以通过该胶体金试纸条进行快速筛查,从而对患者的情况进行快速诊断,有利于疫情的及时控制并采取相应的防控措施。

阳性血清检测结果见表2所列。从表2可以看出,一共进行了83例分子生物学核酸阳性患者的血清测试,针对目标抗体IgM,其中阳性结果68例,阳性敏感性81.79%(68/83);针对IgG目标抗体的筛查结果11例阳性,阳性敏感性13.25%(11/83)。综合IgM和IgG这2个指标同时检测的结果表明，所研制的胶体金新冠病毒抗体IgG/IgM试纸条对新型冠状病毒感染者的筛查具有较高的敏感性，可以用于新冠肺炎的快速筛查。

表2 核酸阳性患者血清样品检测

4 结 论

新型冠状病毒引起的非典型肺炎由于其传染度极高、传染途径广,且没有有效的疫苗以及治疗手段,在全国甚至全世界范围内成为人类命运共同体亟待解决的重大事件。利用IgM、IgG抗体作为重要指标能有效地诊断早期病例,已在国家防控方案中作为病原学确诊证据之一[12],有利于控制病情的传播。

据了解,目前关于基于免疫层析试纸条检测新型冠状病毒检测方案的报道非常少,而已发表论文中将IgM、IgG抗体作为检测标记物的检测方法并不够完善。本文提出在同一根试纸条上,同时使用IgG和IgM 2种抗体作为标志物,双重指标进一步提高了检测的准确度。同时,本文方法通过优化方案达到消除假阳性/假阴性的目的(阴性准确率98.08%)。在优化的条件下,对新冠核酸阳性患者的血清检测,阳性准确率达到81.79%。本文所建立的新冠病毒抗体胶体金试纸条,作为核酸诊断标准的有效补充方法,有利于当前严防严控形势下,提高新冠肺炎诊断的准确性,充分保障疫情防控。

此外,可以通过分析IgM、IgG的具体浓度达到实时监控病人病情,指导医务人员合理用药的效果,这方面会在后续实验中展开进一步详细的探讨和研究。