猪圆环病毒2b型表位嵌合病毒样颗粒在E.coli中的制备及鉴定

冯 华，刘晴坤，2，任春晓，2,刘运超，张改平，2

(1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州450002)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)属于圆环病毒科(Circovirus)、圆环病毒属(Circoviridae)，是一类无囊膜的、直径在17～22 nm的单链环状DNA病毒[1-2]，该病毒是引起一系列重要猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus disease，PCVD)的主要病原[3-5]。其中，PCV2系统性疾病(PCV2-systemic disease，PCV2-SD)是主要由PCV2b病毒引起的一种系统性疾病，主要表现为生长缓慢、呼吸困难、淋巴结肿大、腹泻等。该病主要影响7～16周龄的仔猪，能够造成4%～30%的发病率和4%～20%死亡率，从而使猪场大量减产，导致巨大的经济损失[6]。

PCV2基因组由大小约为1.7 kb的双义DNA组成，包含2个主要的开放阅读框(Open reading frame，ORF)：ORF1(904 bp)和ORF2(702 bp)[7]，分别编码病毒复制相关蛋白Rep(Rep′)和病毒结构蛋白Cap。其中，Cap蛋白是PCV2病毒的主要功能性蛋白，主要行使细胞受体识别、核酸细胞核运送等功能[8]。同时，Cap蛋白也是PCV2主要的免疫原蛋白，包含重要的病毒中和表位，在体外能够自组装成病毒样颗粒(VLP)，常作为血清学检测和疫苗研发的靶标蛋白[9]。大量研究表明，在PCV2 Cap蛋白C端插入外源表位能够同时诱导针对Cap和外源表位的免疫反应[10-11]。因此，在Cap蛋白C端插入其自身的中和表位将有助于进一步提高现有疫苗的保护效率。目前，Cap 蛋白上共鉴定出至少6个表位区域[12-14]，中和表位226LKDPPLNP233被证实具有较好的中和免疫原性，能够诱导体液免疫反应，并参与Cap蛋白构象表位的形成，在亚单位疫苗的研发中具有很好的前景[15-16]。

目前，市场上针对PCV2的疫苗仍然以灭活疫苗为主。相比灭活疫苗，Cap亚单位疫苗免疫原性单一，可以避免潜在的由于灭活不完全造成的免疫动物携带疫苗毒的可能，在未来PCV2清除中将会具有更强的优势。为进一步提高现有亚单位疫苗免疫效率，以目前流行的PCV2b为研究对象，将其自身中和表位226—233位氨基酸序列连接到Cap蛋白C末端，成功构建连接自身中和表位的嵌合Cap蛋白，并对其免疫原性和结构特点进行初步鉴定，以期为研发更为安全、有效、廉价的PCV2疫苗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 载体、菌种及主要试剂

重组载体PE-Sumo载体由本实验室保存；大肠杆菌克隆感受态细胞JM109和表达用感受态细胞BL21(DE3)、DNA Marker DL2000、Primer STAR Max DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶等均购自Takara公司；限制性内切酶BsaⅠ和XbaⅠ购自NEB 公司；核酸胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自OMEGA公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自INALCO 公司；Ni-NTA亲和层析柱购自QIAGEN 公司；蛋白质Marker、Sumo蛋白酶购自Smobio公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和ECL 显色试剂盒购自索莱宝公司；抗组氨酸标签单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠二抗购自Abcam公司；鼠源PCV2 Cap单克隆抗体由本实验室制备保存。

1.2 重组表达质粒的制备和重组表达菌体的构建

利用已经针对大肠杆菌表达系统进行密码子优化的PCV2b(GenBank:AAY969004.1)Cap序列为模板，分别以Capc-F：ATGGTCTCTAGGTATGACGTACCCTCGT和Capc-R：AGTCTAGATTACGGGTTCAGCGGCGGGTCTTTCAGGGGGTTCAAAGGTGGG-T(下划线代表中和表位位置)为上、下游引物进行扩增，将PCV2 Cap中和表位基因构建在Cap基因C端(Capc)；目的片段经过限制性内切酶BsaⅠ和XbaⅠ酶切后，利用T4连接酶将其连接在PE-Sumo载体,并转化到大肠杆菌克隆感受态细胞JM109，挑选阳性质粒进行PCR鉴定，并将其送至上海生物工程有限公司进行测序鉴定，将构建成功的阳性重组质粒命名为PE-Sumo-Capc。

1.3 重组蛋白表达条件的优化和可溶性分析

将PE-Sumo-Capc转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含有Amp+的LB固体培养基上37 ℃培养过夜；挑取单克隆接种于含0.1% Amp+的LB液体培养基中培养过夜后，以1∶100比例将其接种至新鲜的Amp+LB液体培养基中,37 ℃培养至OD600为0.4～0.6 时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，分别在18、22、26、30 ℃条件下诱导表达10～12 h，优化表达时间。之后，按照上述方法在最适表达温度下，分别表达8、10、12、14、16 h，探索最适表达时间。将收获的菌体分别重悬于缓冲液(50 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，pH值为8.0)中，超声破碎菌体分离上清、沉淀，并通过SDS-PAGE凝胶电泳对蛋白质的最适表达条件及其可溶性进行鉴定。

1.4 重组蛋白的纯化及免疫反应性鉴定

收集在优化条件下表达的菌体，重悬于裂解液中，按照上述方法超声破碎，收集上清。以缓冲液(50 mmol/L Tris，250 mmol/L NaCl，pH值为8.0)平衡Ni-NTA亲和层析柱后，将上清置于层析柱中使目的蛋白与柱子充分结合；再以含有终浓度为50 mmol/L咪唑的缓冲液充分清洗层析柱；最后，以含有终浓度为200 mmol/L咪唑的缓冲液对Sumo-Capc蛋白进行洗脱；之后通过SDS-PAGE和Western blot(抗组氨酸标签单克隆抗体为一抗)对目的蛋白进行鉴定。洗脱蛋白经无咪唑缓冲液透析去除咪唑后，按照Sumo蛋白酶说明书对纯化蛋白进行酶切以去除Sumo标签；之后，利用SDS-PAGE对酶切后的目的蛋白进行鉴定，并以鼠源PCV2 Cap单克隆抗体为一抗和HRP标记羊抗鼠为二抗对目的蛋白的免疫反应性进行Western blot鉴定。

1.5 PCV2 VLP动态光散射鉴定及电镜观察

对纯化后的Capc蛋白进行物理特性鉴定，利用动态光散射对纯化后的Capc蛋白的水化半径进行分析。另外，取微量纯化后的Capc蛋白，将其缓慢滴于铜网上，室温静置1 min后用滤纸从液滴边缘将多余液体吸取；同样取微量pH值为7.0的磷钨酸染液，滴于膜上染色约1 min，滤纸移去多余染液，干燥后透射电镜下观察。

2 结果与分析

2.1 重组表达载体PE-Sumo-Capc构建及鉴定

将重组Capc片段插入PE-Sumo载体中BsaⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，并转化JM109感受态细胞，经过培养，利用引物Capc-F和Capc-R对挑取的克隆进行PCR鉴定。2%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约747 bp处出现明显条带，符合预期大小(图1)。将鉴定为阳性的克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定，结果正确。

2.2 重组Sumo-Capc蛋白表达条件的优化和可溶性分析

将重组表达质粒PE-Sumo-Capc转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，对重组蛋白Sumo-Capc的最适表达温度和时间进行优化。收获的菌体经超声破碎分离上清及沉淀后，SDS-PAGE鉴定结果显示，在约48 ku处有明显的条带出现，与预期的重组蛋白Sumo-Capc大小相符，证明目的蛋白表达量较高；经过优化，目的蛋白在26 ℃时能够以可溶形式表达于上清中，并且表达量相比其他温度较高，大肠杆菌本体杂蛋白表达量较低；时间优化结果显示，在26 ℃下表达12 h后，目的蛋白表达量不再增加(图2、3)。因此，重组Sumo-Capc蛋白最适表达条件确定为26 ℃诱导12 h。

M：蛋白质Marker；1、2分别为诱导8 h后的上清和沉淀；3、4分别为诱导10 h后的上清和沉淀；5、6分别为诱导12 h后的上清和沉淀；7、8分别为诱导14 h后的上清和沉淀；9、10分别为诱导16 h后的上清和沉淀M:Protein Marker;1,2 represent supernatant and precipitate induced at 8 h,respectively;3,4 represent supernatant and precipitate induced at 10 h,respectively;5,6 represent supernatant and precipitate induced at 12 h,respectively;7,8 represent supernatant and precipitate induced at 14 h,respectively;9,10 represent supernatant and precipitate induced at 16 h,respectively图3 26 ℃下重组Sumo-Capc蛋白表达时间优化结果Fig.3 Results of expression time optimization of recombinant Sumo-Capc protein at 26 ℃

2.3 重组Sumo-Capc蛋白的纯化、酶切和Western blot鉴定

SDS-PAGE和Western blot(抗组氨酸标签单克隆抗体为一抗)结果显示，超声破碎后上清经过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,能够得到较纯的带有Sumo标签的目的蛋白(图4)。以Sumo蛋白酶对Sumo-Capc蛋白进行酶切去标签，SDS-PAGE结果显示，在约27 ku处显示明显条带，与预期的Capc蛋白大小一致(图5A)；Western blot结果显示，该蛋白质能够与鼠源PCV2 Cap单克隆抗体产生反应，证明纯化后的Capc蛋白具有针对PCV2 Cap单克隆抗体的免疫反应性(图5B)。

2.4 PCV2病毒样颗粒物理特性鉴定

从图6可看出，纯化后的Capc蛋白形成了均一的、直径为17～19 nm的蛋白质聚集体。进一步透射电镜下观察发现，纯化后的Capc蛋白能够自组装形成直径为17～19 nm的病毒样颗粒(图7)。

M：蛋白质Marker；1：裂解液上清；2：上样流穿液；3：洗杂液；4：纯化的Sumo-Capc蛋白M:Protein Marker;1:Supernatant after sonication;2:Flow fluid after sample loading;3:Wash flow fluid;4:Purified Sumo-Capc protein图4 纯化重组Sumo-Capc蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of purified recombinant Sumo-Capc protein

3 结论与讨论

PCV2是引起一系列包括PCV2系统性疾病、PCV2亚临床感染、呼吸性疾病、猪皮炎/肾病综合征等猪圆环病毒相关疾病(PCVD)的主要病原体，对世界范围内生猪养殖业造成了巨大威胁[17]。此外，该病毒具有变异快、传播广、毒力强、难清除等特点，对我国养猪业造成了巨大的经济损失，已成为制约我国生猪产业发展的重要因素之一[7,18]。

疫苗免疫是预防PCVD的主要手段，免疫后能够有效控制PCV2感染和PCVD相关疾病暴发[19]。目前，市场上针对PCV2的疫苗多为灭活疫苗和亚单位疫苗，并且大多数是基于PCV2a型毒株研发[19]。GenBank数据显示，PCV2a型毒株在2003年以前是全球主要流行毒株，之后主要流行毒株变成了PCV2b型[20]，而PCV2b毒株感染也成为我国养猪业面临的重要问题。与现有PCV2a的疫苗相比，基于PCV2b研发的疫苗能够为动物提供更好的保护[21]。另外，由于PCV2当前并不能完全从猪场清除[19]，针对当前流行的毒株不断提高现有疫苗效力成为PCV2疫苗研发的主要方向。因此，本试验以研究基于PCV2b亚型的亚单位疫苗为目的，以期为控制PCV2感染提供更为高效的疫苗候选。

A.Sumo-Capc蛋白的酶切结果(M：蛋白质Marker；1：纯化的Sumo-Capc；2：酶切后的Capc)；B.纯化Capc蛋白的 Western blot 鉴定结果(M：蛋白质Marker；1：纯化的Capc)A.Enzyme digestion of Sumo-Capc(M:Protein Marker;1:Purified Sumo-Capc;2:Capc after enzyme digestion);B.Western blot analysis of purified Capc (M:Protein Marker;1:Purified Capc)图5 Sumo-Capc蛋白的酶切和纯化Capc蛋白鉴定Fig.5 Enzyme digestion of Sumo-Capc protein and identification of purified Capc protein

图6 重组Capc蛋白的动态光散射分析Fig.6 Dynamic light scattering analysis of recombinant Capc protein

病毒样颗粒具有与天然病毒形态完全一致的结构，由于缺乏DNA或RNA等遗传物质不具有感染性，并能够同时激活B细胞介导的体液免疫和细胞免疫反应，有效保护靶动物[22-23]。本研究以PCV2b型毒株Cap基因序列为对象，针对大肠杆菌表达系统进行密码子优化，通过PCR将PCV2病毒中和表位226LKDPPLNP233构建于Cap基因C端，将重组载体转化表达菌后，通过诱导表达、纯化，成功得到连接有自身中和表位的嵌合PCV2b病毒样颗粒。重组蛋白Sumo-Capc的最适表达条件为26 ℃下诱导 12 h，该条件下目的蛋白容易富集并且具有较少的背景蛋白。Western blot鉴定结果显示，纯化后的目的蛋白Capc能够与PCV2单克隆抗体产生特异的反应，初步证明该蛋白质具有针对PCV2 Cap蛋白的免疫反应性。动态光散射和透射电镜分析结果显示，目的蛋白形成了直径为17～19 nm的病毒样颗粒,与前人研究结果相符[24-25]。可见，在Cap蛋白C端插入同源中和表位片段对Cap病毒样颗粒的形成能力没有造成影响。前人研究也发现，插入合适长度的异源表位对PCV2病毒样颗粒的形成无影响[22]。本试验得到的病毒样颗粒粒径并不均一，可能与插入表位的长度和理化特性有关。因而，Cap蛋白C端连接不同长度或具有不同理化特性的插入片段对PCV2病毒样颗粒形成大小的影响需要进一步研究。

图7 电镜观察Capc蛋白自组装形成的病毒样颗粒 Fig.7 Transmission electron micrograph of viruslike particles by Capc protein self-assembly

综上，本试验成功表达了串联PCV2b中和表位的嵌合Capc蛋白，该蛋白质能够与PCV2单克隆抗体产生特异的免疫反应性，并能够形成病毒样颗粒，为后续的动物试验奠定了基础，为PCV2相关疫苗的研究提供新的思路。