中性粒细胞胞外诱捕网通过活化角质形成细胞黑素瘤缺乏因子2炎症小体参与银屑病发生发展

袁旭 邵帅 王刚

第四军医大学西京皮肤医院，西安710032

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，其重要病理特征之一是表皮处中性粒细胞聚集形成微脓疡［1］。随着研究的深入，中性粒细胞的功能越来越受到人们关注。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NET）由中性粒细胞释放，骨架结构为直径15 ～17 nm的染色质纤维［2］，主要由DNA 和瓜氨酸化的组蛋白（citrullinated histone 3，Cit-H3）构成，其上附有中性粒细胞颗粒中的各种蛋白酶、抗菌肽等［3］。NET的形成过程是一种区别于凋亡及坏死等新的细胞死亡方式［4］。病原微生物组成成分如脂多糖等与人体中的免疫复合物及细胞因子能激活中性粒细胞内活性氧系统（reactive oxygen species，ROS），引发髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、中性粒细胞弹力蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和肽基精氨酸脱亚酶Ⅳ（peptidyl arginine deiminaseⅣ，PAD4）的核转位，终致核酸的解聚和释放，产生NET 网状结构［5］。NET不仅在机体抵御病原微生物入侵中发挥重要作用，且能够参与多种自身免疫性疾病发病和进展［4，6］。在系统性红斑狼疮中，NET相关分子能够激活巨噬细胞的炎症小体Nod样受体蛋白3（NLRP3）或黑素瘤缺乏因子2（AIM2），导致白细胞介素（IL）1β 和IL-18 的产生及释放，而IL-1β 和IL-18 又能促使NET 形成，形成正反馈环路促进炎症进展［7-8］。AIM2 炎症小体是双链脱氧核糖核苷酸（doublestranded deoxyribonucleic acid，dsDNA）的受体之一，能够识别外来病原体或自身受损细胞所暴露的DNA，通过活化前体胱天蛋白酶1（caspase-1）介导下游炎症因子如IL-1β的产生及释放参与免疫防御或诱导细胞凋亡［9］。本文探讨以自身DNA和组蛋白作为骨架结构的NET对角质形成细胞AIM2炎症小体的活化作用及其对银屑病免疫微环境紊乱的影响。

材料与方法

一、标本收集

筛选2018 年1-12 月于第四军医大学西京皮肤医院就诊的进展期寻常型银屑病患者，无其他系统性疾病，收集4例患者皮损标本4份，另外4例患者外周血标本4 份。于本院烧伤与整形外科收集健康对照皮肤组织标本4份，于泌尿外科收集15岁以下儿童包皮环切术后的包皮标本3 份。本研究通过第四军医大学西京医院医学伦理委员会批准（批准号：KY20163202-1），所有受试者均签署知情同意书。

二、主要试剂

红细胞裂解液（美国Thermal Fisher 公司）、CD15 人中性粒细胞分选磁珠抗体（美国Miltenyi biotec 公司）、磁珠阳性分选磁柱（美国Miltenyi biotec公司）、佛波酯（PMA，美国Sigma公司）、IL-1β酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）、中性蛋白酶Ⅱ（dispaseⅡ，美国sigma公司）、脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ，美国Thermal Fisher 公司）、即用型正常山羊血清（壮志生物科技有限公司）、中效细胞裂解液（RIPA）、SDS-PAGE凝胶试剂盒。RPMI 1640、Keratinocyte-SFM 培养基（美国Gibco 公司），DAPI、Hoechest 核染料（碧云天生物技术有限公司）。Western 印记试验一抗：AIM2 兔抗（美国Cell Signaling Technology 公司）、IL-1β鼠抗（美国Abcam公司）；二抗：辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠/兔IgG抗体（康为世纪生物科技有限公司）。免疫荧光试验一抗：AIM2 兔抗、MPO 兔抗、NE 兔抗、IL-1β 鼠抗、Cit-H3 鼠抗（英国Abcam 公司）；二抗：CY3/FITC 标记的山羊抗小鼠/兔IgG荧光二抗（康为世纪生物科技有限公司）。

三、方法

1.免疫荧光检测Cit-H3、MPO、NE、AIM2 在银屑病皮损及健康对照皮肤中的表达：取银屑病患者皮损及健康对照皮肤标本组织石蜡切片，经脱蜡、高压抗原修复、即用型正常山羊血清封闭后分别加入以下一抗组合：Cit-H3 抗体和MPO 抗体、Cit-H3抗体和NE抗体或AIM2抗体，于湿盒中4 ℃孵育过夜、洗涤，滴加相应的山羊抗小鼠/兔IgG荧光二抗，室温避光孵育1 ～2 h 后洗涤切片，滴加DAPI 或Hoechst 核染料对细胞核染色，洗涤切片，树脂封片，避光保存至上机检测。

2.分离银屑病患者外周血中性粒细胞：收取银屑病患者外周血4 份（16 ml/份），使用红细胞裂解液裂解红细胞，于300×g 离心10 min，弃上清液，重复2 次；随后用150 μl 磁珠分选液重悬细胞，加入50 μl CD15磁珠抗体混匀，于4 ℃避光孵育15 ～20 min，随后加入5 ml 磁珠分选液洗涤悬液，于300×g 离心10 min，弃上清液，用500 μl 磁珠分选液重悬细胞，加入阳性分选的磁柱中，收集CD15阳性细胞，即中性粒细胞。

3.提取中性粒细胞NET：将获得的中性粒细胞用无血清RPMI-1640 培养基冲悬，按2 × 106个/孔种于A、B 两块12 孔板中，均予50 nmol/L PMA 刺激，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育4 h。吹打并收取A 板中所有悬液，400×g 离心10 min，收集上清液于1.5 ml 离心管中，随后18 000×g离心15 min，弃上清液，加入1 ml PBS轻柔洗涤沉淀，18 000×g再次离心15 min，沉淀即为NET［10］。B 板各孔在PMA 刺激4 h 后，另加入DNaseⅠ（2 U/ml）于37 ℃处理20 min降解NET结构，其余步骤同A板。采用分光光度计定量dsDNA 浓度，A 板127 ng/μl，B 板0.06 ng/μl。

4.人原代角质形成细胞分离培养：取新鲜包皮组织（离体时间＜2 h），冲洗后于75%乙醇浸泡消毒45 s，取出包皮组织，用含双抗的RPMI-1640 培养基冲洗3 遍，减去皮下组织，并将包皮修剪为1.5 cm×1 cm大小的组织块，浸泡于0.25%dispaseⅡ溶液，4 ℃消化过夜。过夜后使用眼科镊分离真表皮，尽量剪碎表皮并用胰蛋白酶于37 ℃消化7 ～10 min，之后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基终止消化，吹打分离细胞后用无菌滤网过滤并收集滤液，于250 × g 离心5 min，用含10%胎牛血清培养基洗涤1次，于250×g离心5 min，弃上清液得到原代角质形成细胞，使用Keratinocyte-SFM 完全培养基重悬细胞并种于小瓶中，置于37 ℃、5%CO2的饱和湿度孵箱中培养。

5.NET处理细胞：将原代角质形成细胞传代培养至第3代，分为4组，各以3×105个/孔接种至6孔板中，细胞完全贴壁后换液，分别加入PBS（对照组）、NET 提取物（NET 组）、经DNase I 处理的NET提取物（NET 降解组）、DNase I（降解剂对照组）刺激细胞48 h，实验重复3次。

6.Western印记检测NET处理后角质形成细胞AIM2 炎症小体及其下游分子的表达：在4 组细胞中加入适量含苯甲基磺酰氟（PMSF）的中效RIPA，冰上静置20 min，刮取并转移各组细胞裂解液于对应的离心管中，于4 ℃以14 000×g离心15 min，弃沉淀，保留蛋白溶液（BCA 法定量）。以15 μg 上样量电泳，经转膜、封闭后加入相应一抗，于4 ℃孵育过夜。加入二抗室温孵育2 h，洗涤后使用ECL 化学发光显影，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/微管蛋白条带灰度值。实验重复3次。

7.ELISA 检测IL-1β 水平：收集对照组与NET组细胞培养上清液，按照ELISA 试剂盒说明书操作，酶标仪测定各样本在450 nm波长处的吸光度，根据标准曲线及各样本对应的吸光度值计算IL-1β浓度。

8.统计学方法：采用GraphPad Prism 7软件，计量资料以±s 表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett-t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、银屑病患者皮损处NET 标记物与AIM2 炎症小体的表达情况

免疫荧光结果显示，银屑病皮损表皮处可见Cit-H3（绿色）和MPO（红色）呈丝网状共染，或Cit-H3（绿色）和NE（红色）共染（图1），健康对照皮肤组织中未检测到Cit-H3、MPO和NE荧光信号。

图1 银屑病皮损表皮中性粒细胞胞外诱捕网结构免疫荧光染色 1A：皮损表皮处可见瓜氨酸化的组蛋白（Cit-H3，绿色）和髓过氧化物酶（MPO，红色）呈丝网状共染，健康对照皮肤无此荧光信号；1B：皮损表皮处可见Cit-H3（绿色）和中性粒细胞弹力蛋白酶（NE，红色）共染，健康对照皮肤无此荧光信号

健康对照皮肤组织中AIM2炎症小体未见明显表达，而银屑病患者表皮处AIM2 蛋白荧光信号明显，且主要位于微脓疡毗邻表皮处。见图2。

二、NET 处理角质形成细胞对AIM2 炎症小体表达的影响

Western印记结果显示，不同处理组细胞AIM2蛋白及下游分子IL-1β前体及IL-1β的蛋白表达水平差异均有统计学意义（F=23.80、5.82、15.64，P ＜0.001），且NET 组均高于对照组（t = 15.14、4.256、8.710，均P ＜0.05），NET 降解组、降解剂对照组与对照组间差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。见表1、图3。

三、NET 处理对角质形成细胞IL-1β 表达的影响

NET组角质形成细胞培养上清液中的IL-1β分泌水平（13.15 ± 3.77）pg/ml 高于对照组（3.61 ±0.20）pg/ml，差异有统计学意义（t = 2.53，P =0.024）。

讨 论

银屑病的发生发展涉及固有免疫及适应性免疫的共同激活，中性粒细胞作为固有免疫系统的重要组成部分，疾病的早期即被趋化并聚集在银屑病皮损表皮处，是银屑病皮损的重要病理特征，但其在银屑病发生发展中的作用仍有待进一步探索。多项研究证实，NET可以通过激活免疫细胞等参与多种自身免疫性炎症进展［11-13］。我们和其他团队的前期研究曾发现，银屑病患者皮损处存在NET，且可加重病情［14］；在动物模型中，使用PAD4 抑制剂抑制NET 形成，或用DNase I 清除NET 结构均可显著减轻咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样表现和炎症反应［15］。然而，NET参与银屑病发生发展的具体机制还需进一步探索。

图2 银屑病皮损表皮黑素瘤缺乏因子2炎症小体免疫荧光染色 皮损表皮处炎症小体荧光信号明显，且主要位于微脓疡毗邻表皮处（白色箭头），健康对照皮肤中基本无此信号

表1 NET处理对角质形成细胞AIM2炎症小体相关蛋白表达的影响（±s）

表1 NET处理对角质形成细胞AIM2炎症小体相关蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。NET：中性粒细胞胞外诱捕网；AIM2：黑素瘤缺乏因子2 炎症小体；IL-1β：白细胞介素1β。与对照组相比，a P ＜0.05；b P ＞0.05

组别对照组NET组NET降解组降解剂对照组F值P值AIM2 1 1.42±0.03a 1.15±0.07b 0.90±0.05b 23.80＜0.001 IL-1β前体1 1.32±0.08a 0.93±0.03b 1.03±0.12b 5.82＜0.001 IL-1β 1 1.40±0.05a 1.07±0.05b 0.96±0.07b 15.64＜0.001

图3 Western 印记检测中性粒细胞胞外诱捕网（NET）处理角质形成细胞后皮黑素瘤缺乏因子2（AIM2）炎症小体及IL-1β前体、IL-1β 的表达 NET 组的相对表达水平均高于对照组，NET 降解组、降解剂对照组与对照组间无明显差异

本研究发现，银屑病患者表皮中浸润的中性粒细胞中有NET结构形成，且皮损微脓疡毗邻的角质形成细胞中可显著表达AIM2炎症小体。体外研究结果证实，NET刺激角质形成细胞后，后者AIM2炎症小体表达水平显著升高，提示NET可促进角质形成细胞中AIM2 的表达。我们进一步检测了AIM2的经典下游细胞因子IL-1β的表达，发现NET刺激组角质形成细胞后可使IL-1β前体和成熟IL-1β的分泌水平明显升高。在银屑病中，IL-1β 是重要的致病促炎因子之一，它能促进角质形成细胞分泌趋化因子如CCL20，趋化γδT 细胞亚群至皮损局部，同时还能激活γδT细胞促使其分泌IL-17A，加剧炎症进程［16］。而采用DNase I 降解NET 结构后，未发现其对角质形成细胞AIM2 和IL-1β 的表达产生促进的影响。以上结果提示，本研究中从银屑病患者外周血中提取的NET 能激活角质形成细胞中炎症小体通路，促进IL-1β的成熟及释放，最终参与银屑病免疫微环境的紊乱。我们在预实验中发现，正常人外周血中性粒细胞提取的NET 有相似的致病效应，这可能是因为无论中性粒细胞来源如何，体外诱导的NET本身即为病理结构，故而能刺激角质形成细胞。

综上所述，本研究采用免疫荧光检测到银屑病患者皮损存在显著高于健康对照皮肤的NET、AIM2。体外研究提示，NET 可促进角质形成细胞的炎症小体通路，加重银屑病皮损局部的免疫紊乱。二者联系的建立，为固有免疫细胞在银屑病发病中的作用提供了新的探究思路，也为靶向NETAIM2及下游炎症因子的特异性治疗提供了初步理论支持。但NET 通过何种机制活化角质形成细胞的炎症小体及其下游炎症因子，还需进一步研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突