稳定同位素标记甲基毒死蜱-D6的合成研究

涂亚辉，邓晓军，钟佳琪，赵超敏，罗 勇，潘 洁，徐仲杰

(1.上海化工研究院有限公司，上海 200062；2.国家同位素工程技术研究中心 上海分中心，上海 200062；3.上海出入境检验检疫局 动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135)

甲基毒死蜱又名雷丹，是一种有机磷杀虫剂，在农业生产上应用较为广泛，但同时会导致大气、土壤、水等自然环境受到污染，并通过一定的富集作用，残留至蔬菜水果等食品，引起人体产生一系列的中毒反应，导致有机磷农药残留食品安全问题频出。因此，世界上许多国家已经针对不同食品类别制定了甲基毒死蜱的最大残留检测限量，使得这类化合物的残留含量检测引起广泛关注[1-3]。

国内外针对有机磷农药甲基毒死蜱残留检测分析方法主要有光电化学法、超高效液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法、基质固相分散法等[4-8]，但是，这些分析方法存在一定的问题，如样品的预处理复杂，基质效应影响较大等，严重影响了分析检测结果的准确性。因此，现代食品安全检测需要开发更准确有效的检测方法。为了解决这些问题，采用同位素稀释质谱法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS)可准确有效地检测食用品中有机磷农药甲基毒死蜱残留含量[9-11]。本文旨在合成稳定同位素标记的甲基毒死蜱-D6作为检测用内标试剂，广泛地应用于高效精确的农药残留食品安全检测，让放心食品进入生活，具有一定实用意义。

对于甲基毒死蜱的合成，有相关文献[12-14]报道以O,O-二甲基硫代磷酰氯为原料，与相应的3,5,6-三氯吡啶-2-醇或其钠盐在水相体系或者两相复合体系中，在相转移催化剂的作用下发生取代反应，合成相应的目标产物。目前国内外尚无关于稳定同位素D标记的甲基毒死蜱的合成及其作为稳定同位素标记内标试剂检测甲基毒死蜱含量的相关报道。本研究结合O,O-二甲基硫代磷酰氯及甲基毒死蜱的工艺合成路线，以三氯硫磷和甲醇-D4为起始原料进行亲核取代反应，得到中间体O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6，然后与3,5,6-三氯吡啶-2-醇作用得到目标产物甲基毒死蜱-D6，可作为稳定同位素内标试剂。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

C-MAGHS7型加热磁力搅拌器：德国IKA公司；RE-52A型真空旋转蒸发器、DLSB-10/40型低温冷却循环泵：上海卫凯仪器有限公司；600 MHz核磁共振谱仪：美国Bruker公司；GC 7890A气相色谱仪：美国Agilent公司；Trace 1310-ISQLT顶空-气相色谱-质谱联用仪：Thermo Fisher。

三氯硫磷：纯度98%，上海化工研究院有限公司；乙醇、甲醇、丙酮、甲苯、二氯甲烷、乙醚、乙腈、苯、正己烷、乙酸乙酯：分析纯(AR)，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠、氢氧化钠：AR，江苏强盛化学试剂有限公司；1-甲基咪唑：纯度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硼酸、三乙基苄基氯化铵：98%，安耐吉化学；甲醇-D4：丰度99atom%D，百灵威科技有限公司；3,5,6-三氯吡啶-2-醇：98%，上海特伯化学科技有限公司。

1.2 实验方法

甲基毒死蜱-D6的总体合成路线示于图1。

图1 甲基毒死蜱-D6的总体合成路线

1.2.1O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6(A3-D6)的合成 合成路线示于图2。称取6.67 g(39.0 mmol)三氯硫磷A1于25 mL的单口圆底烧瓶中，冰盐浴冷却至-5 ℃，在搅拌的条件下向反应体系中缓慢滴加5.61 g甲醇-D4(156.0 mmol)，保持温度为-4～-6 ℃，搅拌15 min，然后向反应体系中加入8 mL冰水以淬灭反应，保持温度10 ℃以下，搅拌15 min，静置分液，取有机相，得到无色液体4.9 g，即产物甲基二氯化物A2-D3，根据气相检测面积归一法计算收率为27.0%(以甲醇-D4计)，纯度99.1%。直接投入下一步反应。

图2 O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6(A3-D6)的合成路线

称取4.90 g(28.9 mmol)的A2-D3，8 mL的丙酮于50 mL的三口烧瓶中，冰盐浴冷却至-5 ℃，在搅拌的条件下向反应体系中缓慢地滴加4.70 g甲醇-D4(115.6 mmol)，保持温度为-4～-6 ℃，搅拌15 min，取10 g质量分数为30%的氢氧化钠水溶液缓慢滴加至反应体系中，同时检测反应体系中的pH，直至pH=10，停止滴加，取8 mL冰水加入到反应体系淬灭反应，搅拌15 min后，静置分液，取有机相，旋蒸除去丙酮试剂，得到无色液体3.1 g，即产物A3-D6，根据气相检测面积归一法计算收率为23.6%(以甲醇-D4计)。

1.2.2甲基毒死蜱-D6的合成 合成路线示于图3。称取1.98 g(10.0 mmol)的3,5,6-三氯-2-吡啶醇，0.48 g(12.0 mmol)的氢氧化钠于配有回流冷凝管和恒压滴液漏斗的100 mL三口圆底烧瓶中，加入30 mL的水，加热搅拌使得固体物质完全溶解，降至室温后向反应体系中投入0.58 g(10.0 mmol)氯化钠、0.12 g(2.0 mmol)硼酸、0.02 g(0.1 mmol)三乙基苄基氯化铵、8.2 mg(0.1 mmol)1-甲基咪唑和20 mL的二氯甲烷，通过滴液漏斗将1.83 g(11.0 mmol)O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6滴加至反应体系中，加热至42 ℃，继续反应1.5 h，停止反应，冷却至室温，静置分液，利用二氯甲烷进行萃取(3×20 mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去二氯甲烷，得到棕色固体。利用正己烷：乙酸乙酯=20∶1进行柱层析提纯，得到白色固体，再用无水乙醇重结晶，得到2.5 g白色晶体，气相纯度为98.3%，同位素丰度为99.0atom%D，收率为69.3%(以A3-D6计)。1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ ppm 7.86(s, 1H)。

2 结果与讨论

稳定同位素标记中间体O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6的纯度及收率是甲基毒死蜱-D6合成的关键因素，因此O,O-二甲基硫代磷酰氯的合成利用天然丰度原料进行条件优化[15-16]。

2.1 O,O-二甲基硫代磷酰氯合成的影响因素

2.1.1三氯硫磷和甲醇的摩尔数之比对甲基二氯化物合成的影响 三氯硫磷与甲醇的投料摩尔数之比对甲基二氯化物的合成有着重要的影响，见表1。

表1 三氯硫磷与甲醇的物质的量比对反应的影响

注: 1)n1∶n2=n(三氯硫磷)∶n(甲醇)；2)收率为气相检测收率，以甲醇计。

由表1结果可知，甲醇与三氯硫磷在低温条件下容易发生取代反应生成甲基二氯化物即A2，目标产物的含量随着甲醇量的增加也逐渐提高，但甲醇过多，反而导致副产物A3含量增加，导致下一步甲基一氯化物A3(O,O-二甲基硫代磷酰氯)合成反应的收率降低。因此，选择三氯硫磷与甲醇的物质的量之比为1∶4作为最佳优化条件。

2.1.2甲基二氯化物和甲醇的物质的量之比对甲基一氯化物合成的影响 甲基二氯化物(A2)和甲醇的物质的量之比对甲基一氯化物(A3)合成的影响结果列于表2。

以甲基二氯化物(A2)为原料进行反应，反应活性降低，进一步取代反应生成甲基一氯化物较为困难，需加入NaOH水溶液调节溶液的酸碱性，促使取代反应继续进行。随着甲醇含量的增加，原料反应完全，目标产物A3含量也逐渐提高，但是相应副产物的含量逐渐增多，影响目标产物的收率。因此，选择A2与甲醇的物质的量之比为1∶4作为最佳优化条件。

表2 甲基二氯化物(A2)和甲醇的物质的量比对反应的影响

注：1)n1∶n2=n(A2)∶n(甲醇)；2)收率为气相检测收率，以甲醇计。

2.1.3反应溶剂对甲基一氯化物(A3)合成的影响 甲基一氯化物的合成是双分子的亲核取代反应，甲氧基负离子在溶剂中易形成氢键被溶剂化，降低其反应活性。向反应体系中增加非质子性溶剂可以避免被溶剂化，不仅可以降低甲醇用量，减少副产物三甲酯的产生，而且减少水解副反应的发生[17]。

筛选不同的非质子性溶剂，进行条件优化筛选，对甲基一氯化物合成的影响列于表3。

表3 非质子性溶剂对A3合成的影响

注：收率为气相检测收率，以甲醇计。

由表3数据可以看出，在反应体系中加入非质子溶剂丙酮可以有效地提高甲基一氯化物(A3)的含量，利于甲基毒死蜱的合成。

2.1.4O,O-二甲基硫代磷酰氯A3合成稳定性实验 通过对O,O-二甲基硫代磷酰氯合成反应条件的优化筛选，第一步反应选择三氯硫磷与甲醇的物质的量之比为1∶4，第二步反应选择A2与甲醇的物质的量之比为1∶4及加入非质子溶剂丙酮作为反应最佳优化条件，利用天然丰度甲醇进行稳定性重复实验，具有较好的重复性，结果列于表4。

表4 稳定性重复实验数据

注：收率为气相检测收率，以甲醇计。

2.2 甲基毒死蜱的合成

根据甲基毒死蜱的合成工艺[13]，按照n(A3)∶n(3,5,6-三氯-2-吡啶醇)∶n(氢氧化钠)∶n(氯化钠)∶n(硼酸)∶n(三乙基苄基氯化铵)∶n(1-甲基咪唑)=1.00∶1.10∶1.20∶1.00∶0.20∶0.01∶0.01的物质的量比，二氯甲烷和水作为溶剂，回流1.5 h，利用二氯甲烷进行萃取，进行柱层析得到目标产物，收率为70.1%(以A3计)，纯度为98.3%。

2.3 丰度实验

经过多次实验条件优化，确定最佳反应合成路线，经重复实验验证后，以甲醇-D4为同位素起始原料进行丰度实验合成甲基毒死蜱-D6，以消耗的甲醇-D4计，甲基毒死蜱-D6的总收率为44.2%，纯度为98.3%，同位素丰度为99.0atom%D。

2.4 产品结构表征

甲基毒死蜱-D6的1H NMR谱图如图4所示。1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ ppm 7.86(s, 1H)。谱图积分为1个氢，与天然丰度的甲基毒死蜱进行对比，甲氧基上的氢被氘原子取代，与甲基毒死蜱-D6结构一致。

图4 甲基毒死蜱-D6的1H NMR谱图

通过对比产品与天然丰度甲基毒死蜱的MS数据，甲基毒死蜱-D6产品的GC-MS图谱(图5)中主峰m/z=131.0，为甲基毒死蜱-D6减去3,5,6-三氯-2-吡啶醇，即[M-198.4+1]+峰，其质量数131.0≈328.47-198.4+1。其中，328.47为甲基毒死蜱-D6的相对分子质量，198.4为3,5,6-三氯-2-吡啶醇的相对分子质量，0.07的质量数在仪器误差之间。可以确定合成的产物为甲基毒死蜱-D6。以甲基毒死蜱-D6的[M-198.43+1]+峰强度计算，丰度为99.0atom%D。

图5 甲基毒死蜱-D6的GC-MS谱图

3 结论

本文以甲醇-D4为稳定同位素标记原料，得到稳定同位素标记中间体O,O-二甲基硫代磷酰氯-D6。经两相复合体系发生取代反应得到甲基毒死蜱-D6，利用简单易得的甲醇-D4作为原料，以三步的取代反应，合成稳定同位素标记的甲基毒死蜱-D6氘代试剂，目前无相关的文献报道。以消耗的甲醇-D4计，甲基毒死蜱-D6收率为44.2%，纯度为98.3%，同位素丰度为99.0atom%D，该合成工艺简单易操作，适用于实验室合成，氘代产品可作为内标标准试剂应用于食品安全农药残留检测。