HSSPMEGC/MSAMDIS用于金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱的初步研究

李延梅,陈 娟,龙 虎,唐俊妮,王月丽

(西南民族大学,四川成都 610041)

金黄色葡萄球菌隶属于葡萄球菌属,是革兰氏阳性菌的代表,在自然界中分布广泛,在空气、水、土壤及人和动物的排泄物中均存在,因此很容易污染食物[1]。不同类型的食物,如肉制品、乳制品、蛋制品及各种剩饭和即食食品中均可检测到。金黄色葡萄球菌引起的食物中毒是世界性的公共卫生问题,每个国家由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件中均占较大比例[2]。据调查显示,在美国,金黄色葡萄球菌是导致食源性疾病发生率较高的5种病原菌之一,每年由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病病例有24万余例[3]。在欧盟,1993～1998年间发生的金黄色葡萄球菌的中毒率达4.5%[4]。在中国,由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病也被时常报道,据估计比例可达32.5%[5]。

自20世纪90年代以来,微生物的挥发性代谢产物得到了广泛的关注。微生物的挥发性代谢产物是细菌、酵母、霉菌在生长过程中产生的代谢产物的重要组成部分,与微生物生命活动和生长数量密切关联,是微生物与周围各种生物进行交流的重要信息[6]。因此,微生物的挥发性代谢产物可以作为微生物生长的指示性标志物。金黄色葡萄球菌的挥发性代谢产物包括酸类、酮类、醛类、醇类、酯类、含氮和含硫等多种化合物。O’Hara等[7]对金黄色葡萄球菌在三种培养基中的代谢特征进行了分析,结果表明,不同培养基质不会改变金黄色葡萄球菌代谢产物的类型,但会影响代谢产物的浓度。Wojciech等[8]分析了金黄色葡萄球菌胰蛋白胨大豆肉汤培养物的挥发性代谢产物得出,3-甲基-丁醛、3-甲基-丁酸、甲硫醇和3-羟基-2-丁酮等是金黄色葡萄球菌释放的主要代谢产物。本课题组前期研究结果包括,通过比较顶空固相微萃取的不同萃取参数对金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的萃取差异,确定了最适宜的萃取条件[9];分析获得了金黄色葡萄球菌在胰蛋白胨大豆肉汤中的挥发性代谢产物类型与特征[10]。

顶空固相微萃取/气相色谱质谱联用(headspace solid phase micro extraction/gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC/MS)是分析微生物挥发性代谢产物的主要方法之一,其发挥了固相微萃取的高效吸附、气相色谱法对复杂混合物的高效分离及质谱在鉴定化合物中的高分辨能力,实现了多组分混合物的一次性定性、定量分析[11-12]。但是,在实际检测中,从GC/MS中得到的离子流图谱,可能会由于色谱的分离能力有限,一些极性、结构比较类似的化合物会部分甚至全部重叠,影响物质的检索[13],从而降低GC/MS方法进行复杂混合物中痕量组分的鉴定。自动质谱光谱反卷积与识别系统(automated mass spectral deconvolution and identification system,AMDIS)则是一种能够自动处理GC/MS所得离子流色谱图中的所有峰,并鉴定是否有目标化合物存在的应用软件,该软件能够对挥发性物质的总离子流图快速、自动地进行解卷积处理,可以提取未知组分更“纯净”的质谱图[14],使复杂离子流色谱图去卷积处理得到“清晰”的单一成分的色谱图及相关成分信息[15]。指纹图谱是指某种物质或者制剂在经过一定处理后,釆用以光谱、波谱、色谱、核磁共振、X射线衍射等为代表的现代分析技术,得到的能够稳定、真实、全面地标示物质特征信息的色谱图或光谱图[16]。通过分析指纹图谱中峰面积的大小以及保留时间和各峰间的相对标准偏差,得出物质信息的种类和比例,可以描述测试样品间的相似程度[17-18]。

本研究以金黄色葡萄球菌ATCC6538为实验对象,在7.5%氯化钠肉汤中培养24 h后,釆用HS-SPME-GC/MS技术检测其挥发性代谢产物,并运用美国国家标准与技术研究院(national institute of standards and technology,NIST)开发的NIST检索程序以及AMDIS软件对挥发性代谢产物进行准确定性分析,结合《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》,拟建立金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱,以期为金黄色葡萄球菌的质量监测及分析提供参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌标准菌株(StaphylococcusaureusATCC6538) 由西南民族大学食品质量与安全实验室保存;胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) 杭州微生物试剂有限公司;7.5% NaCl肉汤培养基、Baird-Parker(BP)琼脂基础、亚碲酸盐卵黄增菌液 青岛海博生物技术有限公司。

Trace DSQ型GC-MS联用仪(配Triplus自动进样器) 美国Thermo公司;50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)萃取头 美国Supelco公司;TR-1701色谱柱(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm) 美国Thermo公司;MOF-4086S低温冰箱、MLS-3020高压蒸汽灭菌锅 日本三洋公司;SW-CJ-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;HZQ-F160振荡培养箱 太仓市实验设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养物的制备 在参考《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》(GB 4789.10-2016)及课题组前期预实验基础上,优化得到了一套固定的培养条件:取S.aureusATCC6538保藏菌液50 μL接种至装有5 mL TSB培养液的血清瓶中,37 ℃,150 r/min条件下培养13 h。用接种针勾取一环活化菌液,划线于BP平板上,在37 ℃条件下,静置培养18 h,至平板上长出灰黑色至黑色,有浅色边缘且周围绕以不透明圈的菌落,放置于4 ℃冰箱中保藏备用。从BP平板上挑取S.aureusATCC 6538单菌落接种5 mL TSB培养液中,于37 ℃,150 r/min条件下培养13 h。将S.aureusATCC6538活化菌液进行10倍梯度稀释至适宜稀释度,吸取菌悬液300 μL接入50 mL 7.5% NaCl肉汤中,于37 ℃下,150 r/min振荡培养,培养至24 h。吸取5 mL细菌培养物转入20 mL顶空瓶内,加入2 g NaCl,加盖密封,作为测试样品。按此方法制备10组测试样品(S1,S2，…,S10),同时,以未接种金黄色葡萄球菌的7.5% NaCl肉汤作为空白对照。

1.2.2 HS-SPME-GC/MS分析条件 萃取条件:采用50/30 μm(DVB/CAR/PDMS)萃取头,在60 ℃温度下,预孵化30 min,萃取30 min。GC分析条件:TR-1701色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),分流模式,分流比为20∶1,流速1 mL/min,升温程序为40 ℃保持3 min,以7 ℃/min升温至260 ℃并保持2 min,载气为99.999%氦气,进样口温度230 ℃,解吸时间2 min。MS分析条件:电子电离源,电子能量70 eV,离子源温度250 ℃,传输线温度260 ℃,全扫描模式,质量扫描范围50～500 amu。

1.2.3 建立金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库 通过NIST检索程序以及AMDIS对测定到的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物进行鉴定,依据金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物在NIST检索程序以及AMDIS匹配度的数值,建立金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库。

1.2.4 建立金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱 对金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物进行GC/MS检测,经AMDIS鉴定,将得到的色谱峰信息分析和数据处理后,采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》得到各图谱间的数据信息,评价数据信息,建立金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱。

1.3 数据处理

采用NIST AMDIS _32软件报告挥发性代谢产物色谱峰的物质名称、保留时间、峰面积、CAS编号及正反匹配度(M,RM),经NIST检索程序(NIST 08)报告匹配度(MF)。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)》得到指纹图谱信息。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库的建立

2.1.1 筛选金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物色谱峰 本研究采用GC/MS测定金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物,同时,测定7.5% NaCl肉汤空白培养基挥发性组分。比较金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的总离子流色谱图(图1)和空白培养基挥发性组分的总离子流色谱图(图2),首先排除金黄色葡萄球菌7.5% NaCl肉汤培养物中响应强度(即峰面积)小于7.5% NaCl肉汤空白培养基的色谱峰,然后选定仅在金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的总离子流色谱图中检测到的色谱峰以及响应强度高于空白培养基的色谱峰。

图1 金黄色葡萄球菌7.5% NaCl肉汤培养物挥发性代谢产物总离子流色谱图Fig.1 Total ion flow chromatography of volatile metabolites from Staphylococcus aureus 7.5% NaCl broth culture

图2 7.5% NaCl肉汤空白培养基挥发性代谢产物总离子流色谱图Fig.2 Total ion flow chromatography of volatile metabolites from 7.5% NaCl broth blank medium

由表1可以看出,在7.5% NaCl肉汤空白培养基中没有检测出4、8、9、11、12、14、15和17号这八个色谱峰,说明这些色谱峰是金黄色葡萄球菌在7.5% NaCl肉汤培养基中生长代谢所产生的;其他色谱峰在7.5% NaCl肉汤空白培养基中被检测出,同时也在金黄色葡萄球菌7.5% NaCl肉汤培养物中检测到,由于金黄色葡萄球菌的生长代谢活动,这些色谱峰在7.5% NaCl肉汤培养物中的响应强度有明显的增加。因此,这17个色谱峰确定为金黄色葡萄球菌生长活动的挥发性代谢产物,进一步进行定性分析。

表1 金黄色葡萄球菌7.5% NaCl肉汤培养物与7.5% NaCl肉汤空白培养基的挥发性代谢产物色谱峰信息Table 1 Chromatography peaks of volatile metabolites of Staphylococcus aureus culturedin 7.5% NaCl broth and 7.5% NaCl broth blank medium

2.1.2 构建金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库 采用NIST检索程序对待鉴定的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的色谱峰进行匹配,同时采用AMDIS软件对待鉴定的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的色谱峰信息进行自动去卷积处理和定性分析。在NIST检索时,当色谱峰和检索显示的化合物之间的正向匹配度(match,M)和反向匹配度(reverse match,RM)均大于800时,则将该色谱峰对应的化合物及其需要的质谱信息导出至AMDIS目标化合物质谱数据库中。然后设置AMDIS的最小匹配度(minimum match factor,MMF)为80,进行自动去卷积处理分析。如果80的匹配度下,该化合物依然可以检测到,则认为该化合物是金黄色葡萄球菌的挥发性代谢产物,并将其保留在目标化合物质谱数据库中;如果未检测到,则将该化合物从目标化合物质谱数据库中移除。通过以上步骤,对通过NIST检索程序匹配到的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的色谱峰所属的化合物进行AMDIS逐一鉴定,并将符合上述匹配度要求的化合物加入到金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库中,作为实验中所测定的总离子流色谱图中挥发性代谢产物的筛选和鉴定参考标准。实验最终确立的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库详细信息如表2所示。

表2 金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库Table 2 Mass spectrometry database of target compounds of Staphylococcus aureus volatile metabolites

由表2可知,采用NIST检索程序以及AMDIS软件对金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的色谱峰进行匹配鉴定后,在NIST检索程序的正向匹配度和反向匹配度均大于800,AMDIS软件的匹配度为80的条件下,最终确定的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库的化合物共有17个,卡西酮的峰面积最大,为107counts×sec,其余物质的峰面积均为106counts×sec。

2.2 金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱的建立

依次将得到的10组色谱图经AMDIS鉴定,10组总离子流色谱图中与确定的含有17个金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库的物质种类及数量完全符合,同时保留时间也基本一致,且符合与NIST检索程序的正向匹配度和反向匹配度均大于800,AMDIS软件的匹配度为80的条件。从GC/MS测定所得的10组总离子流色谱图中,挑选并汇总17个挥发性代谢产物的数据信息,包括积分数据和色谱图数据信息。将这10组金黄色葡萄球菌的17个挥发性代谢产物的数据信息按照一定要求整理后,导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》,得到10组图谱,同时经过设参照图谱(选择S1为参照图谱)、自动匹配、生成对照、相似度评价几个步骤,采用平均数法得到对照指纹图谱及各组图谱的相关信息。图3为中药指纹图谱相似度评价软件生成的10组图谱,由虚线串连的17个峰为测试样品的共有峰,即已确定的17个挥发性代谢产物色谱峰。

图3 10组金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物图谱Fig.3 Chromatograms of 10 sets of Staphylococcus aureus volatile metabolites注:1:2-甲基-丁醛;2:3-甲基-丁醛;3. 2,3-二甲基-戊醛;4:二甲基二硫化物;5:卡西酮;6:2-乙基-1-己醇;7:苯乙酮;8:2-甲基庚醛;9:3-癸醇;10:3-甲基-丁酸;11:环丙基甲基甲醇;12:1-癸-3-炔;13:2-硝基庚烷-2-烯-1-醇;14:3-辛烯-2-醇;15:2-甲基-十一烷醇;16:亚硫酸-异丁基戊酯;17:2-十二烷酮。

表3是由《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》处理得到的10组金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物图谱信息,包括保留时间、共有峰和生成对照指纹图谱的峰面积信息、保留时间相对标准偏差(RSD)及峰面积相对标准偏差(RSD)。表3中列出了10组金黄色葡萄球菌17个共有指纹峰的峰面积,并计算出10组测试样品间各个共有指纹峰峰面积的相对标准偏差。17个色谱峰中,峰面积相对标准偏差均在30%以下。同时,17个共有指纹峰的保留时间一致性非常强,保留时间相对标准偏差在0～0.06%范围内。

表3 10组金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物图谱信息 Table 3 Chromatograms data information of 10 groups of Staphylococcus aureus volatile metabolites

表4是由《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》处理得到的10组金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物图谱的相似度匹配结果,包括参照图谱(S1)与其余9张测试样品图谱相似度(第一行)和将10张测试样品图谱与建立起来的对照指纹图谱的相似度(第二行)。一般情况下相似度在0.9～1.0之间即认为符合建立指纹图谱的要求。由表4可知,10组图谱在两种比较下的相似度均在此范围内,分别最大为0.987、0.994,最小为0.935、0.958。相似度匹配结果表明,10组金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的数量相同,各挥发性代谢产物组分含量稳定,同时进一步表明建立的对照指纹图谱有参考价值,可作为金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的指纹图谱。

表4 金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物图谱的相似度匹配结果Table 4 Similarity match results of chromatograms of Staphylococcus aureus volatile metabolites

3 讨论

迄今,通过挥发性代谢产物对病原微生物进行辨别与区分的报道已有很多。Rees等[19]分析了来源于临床的多种细菌和霉菌的挥发性代谢产物特征,采用随机森林算法确定了不同病原菌之间的差异代谢产物,并通过主成分分析法呈现了不同病原菌挥发性代谢产物的差异性。Ratiu等[20]采用蒸腾型离子迁移光谱分析了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的挥发性代谢产物,运用主成分分析法对三种病原菌产生的不同离子流轮廓进行了区分。Xu等[21]等检测了鼠伤寒沙门氏菌污染的猪肉的挥发性代谢产物和可溶性小分子代谢产物,采用偏最小二乘法对代谢产物进行分析,可以有效区分自然污染肉样和鼠伤寒沙门氏菌人工污染肉样。Hettinga等[22]对乳房炎乳中病原菌的挥发性代谢特征进行了分析,采用人工神经网络对金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌的挥发性代谢产物轮廓进行分析,可以实现乳房炎乳中四种病原菌的有效区分。然而,细菌挥发性代谢产物指纹图谱的相似度匹配能够将细菌的挥发性代谢产物的组成信息转化为明确的微生物鉴定标志,与上述采用的各种细菌挥发性代谢产物辨别方法有本质区别。HS-SPME-GC/MS-AMDIS结合挥发性代谢产物的指纹图谱相似度匹配的鉴定方法操作简单,耗时短,提高了微生物鉴定的效率,可运用于金黄色葡萄球菌的质量监测及分析。

4 结论

金黄色葡萄球菌ATCC6538在7.5% NaCl肉汤培养基中总共鉴定出17个挥发性代谢产物,将17个化合物的质谱信息导入到AMDIS软件中,建立金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)》进行处理,以国家食品药品监督管理总局颁发的《中药注射剂指纹图谱的技术要求(暂行)》和建立的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物目标化合物质谱数据库为参考依据,确定了10组金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的17个共有指纹峰,建立了金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物指纹图谱。