不同负荷剂量高强度间歇训练对高血压肾病大鼠肾脏损伤的影响

张敏 彭朋 秦永生 何瑞波 马刚

摘 要：目的：以自發性高血压大鼠（SHR）为模型，观察不同负荷剂量高强度间歇训练（HIIT）对肾脏损伤的影响并探讨细胞外基质（ECM）代谢与肾小管上皮-间充质转分化（EMT）在其间的可能作用机制，为高血压肾病患者完善健康管理以及优化运动康复方案提供依据。方法：45只雄性SHR按照随机数字表分为安静组（SHR-Sed）、低负荷剂量HIIT组（SHR-loHIIT）和高负荷剂量HIIT组（SHR-hiHIIT），同时将10只Wistar-Kyoto大鼠作为正常血压对照组（WKY）。WKY和SHR-Sed组在鼠笼内安静饲养;SHR-loHIIT和SHR-hiHIIT组分别进行18周不同负荷量HIIT，两组运动强度保持一致，但SHR-loHIIT组总负荷剂量仅为SHR-hiHIIT组的1/4。实验后，利用无创血压仪检测尾动脉血压;测定24 h尿蛋白、血尿素氮（BUN）和血清肌酐（SCr）含量评价肾功能;过碘酸-希夫（PAS）和马森（Masson）染色进行肾脏病理组织学观察并获取肾小球和肾小管损伤评分以及纤维化指数;透射电子显微镜观察肾脏组织超微结构;免疫印迹测定ECM合成因子—转化生长因子β1（TGF-β1）、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）、结缔组织生长因子（CTGF）以及ECM降解因子—基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和组织金属蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）蛋白表达量;免疫组织化学染色检测肾小管EMT标志物—α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏蛋白（E-CA）的分布与表达量。结果：1）肾脏损伤与纤维化：与WKY组比较，SHR-Sed组血压升高，肾小球萎缩、基底膜增厚、间质胶原纤维大量沉积，足细胞数量减少、足突融合破坏，肾小球和肾小管损伤评分以及纤维化指数升高，肾功能下降（P<0.05）;与SHR-Sed组比较，SHR-loHIIT组血压降低，肾小球和肾小管病变减轻，纤维化指数以及组织损伤评分下降，肾功能改善（P<0.05），而SHR-hiHIIT组血压水平、病理组织学变化、组织损伤评分以及纤维化指数进一步升高（P<0.05），但肾功能无显著性变化（P>0.05）。2）ECM代谢通路：与WKY组比较，SHR-Sed组TGF-β1、p-Smad2/3、CTGF蛋白表达上调（P<0.05），MMP-9/TIMP-1比值下降（P<0.05）;与SHR-Sed组比较，SHR-loHIIT组TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF蛋白表达下调（P<0.05），MMP-9/TIMP-1比值升高（P<0.05），而SHR-hiHIIT组MMP-9/TIMP-1比值下降（P<0.05），TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF蛋白表达水平无显著性变化（P>0.05）。3）肾小管EMT：与WKY组比较，SHR-Sed组肾小管上皮中E-CA表达下降、肾小管上皮和间质α-SMA升高（P<0.05）;与SHR-Sed组比较，SHR-loHIIT组E-CA表达升高、α-SMA下降（P<0.05），而SHR-hiHIIT组E-CA和α-SMA分布与表达量无显著性变化（P>0.05）。结论：长期HIIT对高血压肾病大鼠的健康效应与负荷剂量有关，低负荷剂量HIIT通过促进ECM降解、降低ECM合成并抑制肾小管EMT减轻肾脏纤维化，而高负荷剂量HIIT则通过抑制ECM降解（但对ECM合成无影响）加重肾脏纤维化;此外，高负荷剂量HIIT并未进一步促进EMT，因此高强度运动诱导的肾脏纤维化可能具有可逆性特征。研究提示，心血管疾病患者以HIIT作为主要方式进行运动康复时应持谨慎态度并采用低负荷剂量，其临床决策（可行性、安全性和有效性）仍需更多循证证据支持。

关键词：高血压肾病;肾脏损伤;高强度间歇训练;负荷剂量;细胞外基质;上皮-间充质转分化

中图分类号：G804.2 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2020）06-0054-11

Abstract：Objective： Spontaneous hypertensive rats （SHR） were used as animal models to explore the effect of different load doses of high-intensity interval training （HIIT） on renal fibrosis and investigate the possible mechanism of extracellular matrix （ECM） metabolism and renal tubular epithelial-mesenchymal transition （EMT）， so as to provide the optimal exercise protocol for the health management of patients with hypertensive nephropathy. Methods： 45 male SHR were divided into sedentary （SHR-sed）， low load-dose （SHR-loHIIT） or high load-dose （SHR-hiHIIT） groups according to a random number table， at the same time， ten Wistar Kyoto rats were used as normal blood pressure control group （WKY）. Animals in WKY and SHR-Sed groups were bred quietly in cages， and those of SHR-loHIIT and SHR-hiHIIT groups performed 18-week different load dose of HIIT. Training intensity maintained consistent but the total load dose of SHR-loHIIT group was only 1/4 of SHR-hiHIIT group. After the experiment， parameters were measured including blood pressure of the tail artery by non-invasive blood pressure monitor; renal function by 24 h urine protein （UP）， blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （SCr） content; histopathological observation by periodic acid-Schiff （PAS） and Masson staining to obtain glomerular and tubular injury score and fibrosis index; ultrastructure of kidney tissue by transmission electron microscope; protein expression levels of ECM synthesis factors such as transforming growth factor β1 （TGF-β1）， phosphorylated Smad2/3 （p-Smad2/3） and connective tissue growth factor （CTGF）， and ECM degradation factors such as matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and tissue metalloproteinase inhibitor-1 （TIMP-1） by Western blot; distribution and expression of smooth muscle actin （α-SMA） and E-cadherin （E-CA） by immunohistochemical staining. Results： 1） Renal injury and fibrosis：Compared with WKY group， SHR-Sed group has increased blood pressure， glomerular atrophy， thickening of the basement membrane， large deposition of interstitial collagen fibers， reduced number of podocytes， foot processes fusion and destruction， glomerular and tubular damage scores as well as fibrosis index increased， renal function decreased （P<0.05）; compared with SHR-Sed group， blood pressure decreased， lesions in the glomerulus and tubules alleviated， fibrosis index and the tissue injury score decreased， and renal function improved （P<0.05） in the SHR-loHIIT group， while the blood pressure level， histopathological change， tissue injury score glomerular and fibrosis index further increased （P<0.05）， however， there was no significant change in renal function （P>0.05） in the SHR-hiHIIT group. 2） ECM metabolism pathway：Compared with WKY group， protein expressions of TGF-β1， p-Smad2/3 and CTGF up-regulated （P<0.05）， and the ratio of MMP-9/TIMP-1 decreased （P<0.05） in SHR-Sed group; compared with SHR-Sed group， protein expressions of TGF-β1， p-Smad2/3 and CTGF up-regulated （P<0.05）， and the ratio of MMP-9/TIMP-1 increased （P<0.05） in SHR-loHIIT group; the ratio of MMP-9/TIMP-1 decreased （P<0.05）， and there was no significant change in the protein expression levels of TGF-β1， p-Smad2/3 and CTGF （P>0.05） in SHR-hiHIIT group. 3） Renal tubular EMT：Compared with WKY group， E-CA expression decreased in renal tubular epithelium and α-SMA increased in tubular epithelium and interstitium （P<0.05） in SHR-Sed group; compared with SHR-Sed group， E-CA expression increased and α-SMA decreased （P<0.05） in SHR-loHIIT group， while distribution and expression of E-CA and α-SMA had no significant changes （P>0.05） in SHR-hiHIIT group. Conclusion：Health effect of long-term HIIT on hypertensive nephropathy are load-doses dependent. Low load-dose HIIT reduces renal fibrosis by promoting ECM degradation， reducing ECM synthesis and inhibiting renal tubular EMT， while high load-dose HIIT aggravates renal fibrosis via inhibiting ECM degradation （but has no effect on ECM synthesis）; in addition， high load-dose HIIT do not further promote EMT， thus high intensity training-induced renal fibrosis may have reversible characteristics. This study suggests that patients with cardiovascular disease should be cautious to adopt HIIT as main modality in exercise rehabilitation and use low load dose， and the clinical decision （feasibility， security and availability） still needs to be further confirmed by evidence-based medicine.

Key words： hypertensive nephropathy; renal injury; high-intensity interval training; load doses; extracellular matrix; epithelial-mesenchymal transition

高血压是全世界最常见的心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD），可并发心脏、血管、脑、肾脏、视网膜等终末器官损害，严重影响患者的身心健康和生活质量[1]。肾脏是高血压最常累及的靶器官之一，持续血压升高通过神经体液途径造成肾脏损伤并逐渐出现肾脏纤维化，最终发展为肾功能衰竭（肾衰）和尿毒症，称为高血压肾病[2]。肾脏纤维化是各种原因导致肾衰的必经阶段，主要表现为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常积聚、肾单位数量减少以及肾小球滤过率下降，从而造成肾脏不可逆的损伤[2]。转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）/Smad信号通路[3]和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）/组织金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）稳态平衡[4]分别介导ECM合成与降解，此外TGF-β1/Smad还可通过调节肾小管上皮-间充质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）诱导上皮细胞向具有更强ECM分泌能力的肌成纤维细胞转化而参与肾脏纤维化的形成与进展[3]。调控TGF-β1/Smad信号活性和MMP-9/TIMP-1平衡能够减轻肾脏ECM沉积和EMT进程[3]，因此是防治肾脏纤维化的重要生物学靶点。

研究指出，体力活动水平与肾病患者生存率显著正相关[5]，且运动对患者具有多维度健康效益[6]，包括降低心血管危险因素、改善身体机能，提高运动能力和生活质量。中低强度持续有氧运动（简称有氧运动，下同）如跑步、游泳、骑车等是肾病患者运动康复的主要方式[6， 7]，然而由于持续时间较长、枯燥乏味，患者往往难以长期坚持[8]。如何花费更少的时间达到同样或更佳的锻炼效果成为众多人追求的目标。作为近年来新兴的运动模式——高强度间歇训练（high-intensity interval training，HIIT），已被广泛证实能够明显改善健康受试对象（普通人、运动员、实验动物）的生理机能及运动能力，具有时效性、趣味性、易于接受等突出优势[9]。然而HIIT对CVD（尤其是实验动物）的作用报道不一[10-14]，其是否适用于肾病患者鲜有关注。课题组前期的研究证实，18周中等强度间歇运动改善了自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）病理性心脏肥大[11]，而高负荷剂量HIIT（20～56 min/d，3～5 d/w）后则发生心功能恶化[12]，表明长期间歇训练对高血压的影响与运动强度有关，这在Holloway等[10， 13]的研究中同样得到证实，HIIT的作用遭到质疑。值得注意的是，4～20 min/d、2～3 d/w的低负荷剂量HIIT能够改善CVD患者心脏重塑[15-16]，提示HIIT的作用可能与负荷剂量有关。为验证这一推断，本研究以SHR为模型，观察不同负荷剂量HIIT对肾脏损伤和肾脏纤维化的影响并探讨ECM代谢和肾小管EMT在其间的可能作用机制，以期为高血压肾病患者完善健康管理以及优化运动康复处方提供依据。

1 研究对象与方法

1.1 實验动物与分组

10只Wistar-Kyoto大鼠以及45只3月龄雄性SHR，体重（216±14）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2018-0027。将SHR按照随机数字表随机分为安静组（SHR sedentary，SHR-Sed）、高负荷剂量HIIT组（SHR high load-dose HIIT，SHR-hiHIIT）和低负荷剂量HIIT组（SHR low load-dose HIIT，SHR-loHIIT），每组n=15。将Wistar-Kyoto大鼠作为正常血压对照组（WKY）。大鼠饲养环境：温度（24～26）℃，湿度50%～60%，12：12 h明暗周期，分笼（5只/笼）标准饲料饲养，自由进食水。WKY和SHR-Sed组动物在鼠笼内安静饲养，SHR-hiHIIT和SHR-loHIIT组分别进行18周不同负荷剂量的HIIT。

1.2 运动方案

所有动物先进行5 d适应性跑台（段氏DSPT-208型，安徽正华生物仪器设备有限公司）训练（强度：10～15 m/min，坡度：0°，时间：10～15 min/d）。随后按照课题组既往建立的递增负荷运动实验测定峰值跑速（maximal velocity，Vmax）[11-12]：起始负荷5 m/min，每2 min增加1.5 m/min，直至力竭（坡度始终为0°），记录最后一级负荷对应的跑速即为Vmax。随后SHR-hiHIIT和SHR-loHIIT组分别进行18周不同负荷剂量HIIT，分别于第4、8、12和16周重新测定Vmax并及时调整运动强度[12]。两组运动强度相同，从第3周开始，SHR-hiHIIT组每次运动时间、重复次数以及运动频率逐渐高于SHR-loHIIT组，具体训练方案详见表1。

1.3 尾动脉血压测定

每周训练前以及末次训练后48 h，大鼠处于清醒、安静状态下，采用智能无创血压测量仪（BP-2010E，日本Softron公司）测定尾动脉血压，包括收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压（diastolic blood pressure，DBP），连续监测三次，取均值。

1.4 尿液、血液标本采集以及组织取材

末次尾动脉血压测定后将大鼠置于单独的代谢笼（Columbus CLAMS，美国Columbus公司）中24 h，给予禁食（不限制饮水），用50 mL离心管持续收集尿液，4℃、3000 rpm离心10 min取上清。大鼠称量体重后腹腔注射戊巴比妥钠溶液（剂量：0.1 mg/kg）麻醉并仰卧固定，腹主动脉取血5 mL，4℃、3000 rpm离心20 min取血清。分离心脏、肾脏和肾上腺以及胸腺，迅速在冷生理盐水中洗涤，滤纸吸干水分后分别称重（mg）并计算与体重（g）的比值作为心脏质量指数、肾脏质量指数、肾上腺质量指数和胸腺质量指数。将左侧肾脏分为两部分，一部分用经4%甲醛溶液固定12 h后经脱水、包埋、制作4 μm组织切片并用光镜进行病理组织学观察，另一部分用戊二醛和锇酸固定并进行组织超微结构观察（醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色）;右侧肾脏投入液氮中进行蛋白印迹分析。

1.5 肾功能以及血清皮质酮含量检测

采用光栅分光光度计（722 型，上海分析仪器厂）以双缩脲法检测尿液样本24 h尿蛋白含量（urine protein，UP）（单位：mg/24 h），全自动生化分析仪（AU680，美国Bachman公司）以酶法检测血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）（单位：mmol/L）及血清肌酐（serum creatinine，SCr）（单位：μmol/L）含量。利用全自动酶标仪（Multiskan MK3，美國Thermo公司）以酶联免疫吸附法测定血清皮质酮（单位：pg/mL）。严格按照试剂盒（均购自武汉博士德生物工程有限公司）说明进行操作，每个指标重复三次，取均值。

1.6 肾脏病理组织学观察

组织切片脱腊后分别进行过碘酸-希夫（periodic acid–Schiff，PAS）染色和马森（Masson）染色，中性树胶封片。每只大鼠取3张切片，每张切片随机选取10个高倍视野（×400），光学显微镜（IX71型，日本奥林巴斯公司）下观察肾脏组织病理形态改变情况。PAS染色观察肾小球和肾小管病理变化，Masson染色观察肾脏间质胶原纤维的变化。采用半定量评分系统分析肾小球或肾小管损伤，按损伤程度由轻到重评分为0～3分：0分，正常肾脏;1分（轻度损伤），病变范围<25%;2分（中度损伤），病变范围占25%～50%;3分（重度损伤），病变范围>50%[17-18]。用Masson染色切片镜下蓝色面积与所观察视野面积的比值代表纤维化指数。

1.7 透射电子显微镜观察

组织样品经2.5%戊二醛和1%锇酸固定2 h，PBS洗涤3次（每次5 min），梯度浓度乙醇脱水15 min。环氧丙烷渗透组织，室温下环氧树脂和丙酮包埋24 h，制作50～60 nm切片，3%醋酸双氧铀和枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜（JEM-2100 Plus，日本松永电子公司）观察肾脏组织超微结构。

1.8 免疫印迹分析

肾脏组织匀浆后于4°C、12 000 g离心5 min，取上清，考马斯亮蓝测定总蛋白质浓度。10% SDS-PAGE分离蛋白质，随后转移至PVDF膜上。室温下将PVDF膜在5%脱脂牛奶中孵育3 h。将PVDF膜与TGF-β1（稀释比1∶2000，Santa cruz公司）、Smad2（稀释比1∶1000，Abcam公司）、Smad3（稀释比1∶1000，Abcam公司）、磷酸化Smad2（p-Smad2）（稀释比1∶1000，Abcam公司）、磷酸化Smad3（p-Smad3）（稀释比1∶1000，Abcam公司）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）（稀释比1∶2000，Santa cruz公司）、MMP-9（稀释比1∶2000，Santa cruz公司）和TIMP-1（稀释比1∶2000，Abcam公司）一抗4℃过夜。TBST洗涤4次（每次10 min），加入鼠抗兔二抗（辣根过氧化物酶标记的IgG）（稀释比1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司），室温孵育3 h。使用ECL发光成像，扫描各条带灰度值，使用ImagePro Plus 6.0图像分析软件进行半定量。内参蛋白为β-actin（稀释比1∶10 000，Abcam公司），将目的蛋白灰度值与β-actin的比值作为相对表达量，计算各组蛋白相对表达量与WKY组的比值作为相对表达率。

1.9 免疫组织化学染色

肾组织切片脱蜡，抗原修复30 min。室温下用甲醇和过氧化氢灭活内源性过氧化物酶后，将载玻片于37°C下用0.5%牛血清白蛋白封闭60 min，加入α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-CA）一抗（稀释比1：200，Abcam公司）4°C过夜。用PBS洗涤后，将样品与鼠抗兔二抗（稀释比1：500，武汉博士德生物工程有限公司）37°C孵育1 h，PBS洗涤3次（每次5 min）。滴加DAB显影液，室温下用苏木精复染细胞核5 min，乙醇梯度脱水，二甲苯洗涤，中性树胶密封固定。使用光学显微镜（IX71型，日本OLYMPUS公司）选取10个高倍视野（×400）拍照，Image-Pro Plus 6.0分析软件计算平均光密度（optical density，OD）。

1.10 统计学处理与分析

使用SPSS 22.0统计软件包对实验结果进行统计分析和处理。所有数据以“平均值±标准差”表示，采用Origin 8.5作图。生存分析以Kaplan-Meier曲线表示， 生存率的组间比较采用 Log-rank检验;血压的时程变化使用重复测量的方差分析;其他各参数的组间比较使用单因素方差分析，多重比较使用Tukey检验。显著性水平定为α=0.05。

3 讨论

3.1 不同负荷剂量HIIT对高血压肾病大鼠肾脏损伤以及纤维化的影响

在本研究中，低负荷剂量HIIT能够降低SHR血压水平，同时减轻高血压诱导的肾脏损伤与纤维化并提高肾功能，因此对高血压肾病具有改善作用。这与针对中等强度游泳、跑台等方式的研究结果一致[19-20]，提示低负荷剂量HIIT与传统有氧运动的作用效果相似。更为重要的是，SHR-loHIIT组采用的负荷剂量（58 min/w）明显低于美国运动医学会（American College of Sports Medicine，ACSM）推荐CVD患者发展或维持心血管健康和体适能的最低推荐量（150 min/w中等强度或75 min/w高强度运动[21]），因此具有明显的时效性。研究指出[22]，运动的健康效应在一定程度上与运动剂量正相关，故推测增加运动量可能会进一步改善肾脏损伤。然而出乎意料的是，高剂量HIIT后血压水平不降反升，肾脏损伤与纤维化进一步加重，但肾脏功能并未受明显影响，可能与肾脏具有强大的代偿能力有关，同时生存率和死亡率与其他各组并无统计学差异。Aparicio等[23]的研究同样证实，Wistar大鼠进行4 d/w共12周的高强度抗阻间歇训练后肾脏形态和结构出现异常，间质结缔组织面积增加，但肾功能无明显变化。上述结果提示，维持相同运动强度，HIIT对高血压肾病的作用效果呈现运动负荷剂量依赖性。研究发现，肌肉严重损伤时释放肌红蛋白（运动性横纹肌溶解症）损伤肾小管以及肾脏缺血-再灌注（运动期缺血、恢复期再灌注）是高强度剧烈运动诱导肾损害的重要原因[24]。

3.2 不同负荷剂量HIIT对高血压肾病大鼠ECM代谢和肾小管EMT影响

ECM合成与降解失衡是肾脏纤维化的直接原因，这一过程主要受TGF-β1/Smad信号转导通路[3]和MMP-9/TIMP-1稳态平衡[4]的调控。在本研究中，SHR-Sed组TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF表达上调，提示TGF-β1/Smad途径激活并上调下游靶基因CTGF表达，后者以自/旁分泌方式作用于肾脏局部，促进ECM合成[3];MMP-9表达下调而TIMP-1上调，MMP-9/TIMP-1比值下降，说明TIMP-1对MMP-9的抑制效应增强，ECM降解速率下降。因此，SHR肾脏纤维化的形成是ECM合成增加和降解减少共同作用的结果。低负荷剂量HIIT后TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF表达降低，说明ECM合成减少;MMP-9上调而TIMP-1下降，MMP-9/TIMP-1比值升高，表明TIMP-1对MMP-9的抑制作用得以解除，ECM降解增多。由于TIMP-1同样是TGF-β1下游靶基因[25]，TGF-β1上调TIMP-1表达而间接抑制MMP-9活性，故低负荷剂量HIIT还可通过抑制TGF-β1/Smad途径加速ECM降解。总之，低负荷剂量HIIT同时促进ECM降解并抑制其合成而改善SHR肾脏纤维化，TGF-β1/Smad信号途径和MMP-9/TIMP-1稳态平衡则是规律运动发挥肾脏保护效应的关键靶点。然而高负荷剂量HIIT后，TGF-β1/p-Smad信号活性较SHR-Sed组并无显著性改变，提示ECM合成未受影响。但在一项长期高强度耐力训练诱导健康大鼠心脏纤维化的研究中，心肌TGF-β1明显上调[26]，研究結果存在差异可能与实验动物的健康状态、训练方案以及组织特异性有关。有趣的是，SHR-hiHIIT组TIMP-1表达下调，似乎暗示TIMP-1抑制ECM降解的作用减弱，然而MMP-9表达量和MMP-9/TIMP-1比值同时下降则说明TIMP-1对MMP-9活性的抑制作用进一步增强，ECM降解减少。此外，TIMP-1下降而TGF-β1无显著性变化，提示尚存在其他调控TIMP-1的信号途径。总之，长期高负荷剂量HIIT通过抑制ECM降解而加重肾脏纤维化，但对ECM合成并无明显影响。

近年来的研究发现[27]，肾小管EMT是导致肾纤维化的核心机制，因肾纤维化时超过1/3的间质肌成纤维细胞来源于局部肾小管上皮发生的EMT。EMT是上皮细胞向位于细胞基质的间质细胞转化的过程，肾脏EMT主要发生在肾小管，上皮细胞在丢失细胞间紧密连接并失去极性的同时，其表型亦发生显著改变，如上皮细胞标志物E-CA逐渐丧失，转而表达更多的间质细胞表型α-SMA[27]。研究发现[3]，EMT主要受TGF-β1/Smad信号途径的调控。本研究同样证实SHR发生EMT，即SHR-Sed组TGF-β1/Smad信号激活的同时肾小管上皮细胞E-CA表达减少，而间质中α-SMA明显上调。低负荷剂量HIIT则通过下调间质α-SMA以及上调肾小管上皮E-CA表达而抑制肾脏EMT进程，这在中等强度有氧运动（跑台[28]、游泳[19]）的研究中亦得到佐证，其机制可能与运动下调TGF-β1/Smad[19]以及非Smad依赖性信号途径[28]活性有关。出乎意料的是，SHR-hiHIIT组E-CA和α-SMA的分布和表达量与SHR-Sed组并无差异，这与该组TGF-β1/Smad信号活性无显著性变化相吻合，提示高负荷剂量HIIT在加重肾脏纤维化的同时未促进肾小管EMT进程。高强度运动对肾脏EMT的影响鲜有报道，在针对心脏的研究中，Aschar等[29]发现，小鼠高强度耐力训练促进心房纤维化，但肌成纤维细胞数量并未增多，Benito等[26]证实，16周剧烈运动诱导健康大鼠心脏纤维化，然而停训8周后则完全逆转。据此推断，高强度运动诱导的与疾病造成的纤维化存在本质区别，运动性肾脏纤维化的发生机制可能与运动性心肌纤维化类似并同样具有可逆性特征，若及时停训或降低训练负荷，肾脏纤维化程度将得以缓解，然而这一假设尚需实验验证。

3.3 对HIIT作用的辩证审视

HIIT对于CVD的心脏效应尚未明确，饶有兴趣的是，多数针对CVD患者的研究以及临床Meta-分析均证实HIIT的效果与传统有氧运动相似[15， 16]，而动物实验却结论不一[10-12]。通过分析发现，人体试验多采用4～20 min/d、2～3 d/w的低负荷剂量，而动物实验则为了保证研究设计的严谨性，选择与有氧运动相匹配的高负荷剂量（50～60 min/d、 4～5 d/w），可见HIIT的健康效应与负荷剂量有关。Holloway等[10， 13]以及课题组前期研究[12]同样证实了高负荷剂量HIIT对CVD大鼠的有害作用，本研究设计了两种负荷剂量模式并进一步发现，在维持运动强度不变的前提下，降低负荷剂量则出现与SHR-hiHIIT组截然不同的结果，因此我们认为，HIIT方式本身并无不妥，针对不同生理状况进行合理的负荷安排是HIIT能否产生良性适应的关键。处于健康状态的人或实验动物，代偿和/或恢复能力较强，故不同负荷剂量HIIT均可诱导机体产生良性适应;然而疾病状态下（尤其是CVD），由于各器官机能下降，长期高负荷剂量HIIT导致机体处于过度训练状态并造成组织损伤，这在过量运动诱导心脏适应不良的多项研究中亦得到印证[26， 30]。需要提及的是，由于人类具有意识和主观能动性，HIIT的趣味性和刺激性对CVD患者而言更易接受[30]，但长期反复高强度跑台被动运动则易造成动物身心应激并进一步加重病情[31]。本研究中SHR-hiHIIT组大鼠即处于慢性应激反应状态，血清皮质酮升高近3倍，Benghuzzi等证实[32]，持续超生理水平皮质酮能够损害肾脏结构与功能。此外，SHR-hiHIIT组血压呈现“双相反应”特征（先下降后升高），这与该组负荷剂量随训练时间递增的趋势相吻合，进一步证实HIIT的作用存在负荷剂量依赖性，表明针对CVD存在“负荷阈值”（安全上限），超出阈值将产生负面影响。Benito等[26]等针对心肌纤维化的研究证实，高强度运动在康复初期能够促进心脏生理适应，而长期心脏超负荷则最终引起心脏病理性重塑。总之，本研究结果提示，高血压肾病患者以HIIT作为运动康复方式时应采取低负荷剂量。

4 结论

长期HIIT对高血压肾病大鼠的健康效应呈现负荷剂量依赖性，其机制与不同负荷剂量HIIT对TGF-β1/Smad信号途径介导ECM代谢和EMT的调控存在差异有关，其中低负荷剂量HIIT通过促进ECM降解、降低ECM合成并抑制肾小管EMT减轻肾脏纤维化，而高负荷剂量HIIT则通过抑制ECM降解（但对ECM合成无影响）加重肾脏纤维化;此外，高负荷剂量HIIT并未进一步促进EMT，因此运动诱导的肾脏纤维化可能具有可逆性特征。

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