两株淡水湖泊常见沉水植物共培养对斜生栅藻的抑制作用

马浩天， 张 飞， 张宏江， 史飞飞， 崔红利， 李润植

(山西农业大学 分子农业与生物能源研究所， 太谷 030801)

水生生态系统由自养生物、异养生物和分解生物组成。各种生物群落及其与水环境的相互作用，维持着特定的物质和能量循环，从而构成了一个完整、平衡的生态单元。但是该系统也会由于某个种群的过度扩大而紊乱，例如藻类[1]。作为主要生产者，藻类广泛分布于各种环境的水体，生长速度快，经常成为水生生态系统的优势种，因而可能造成大规模暴发而导致水生生态系统的退化；另一方面，沉水植物是水生单元的重要组成部分，它具有保持水体清澈、增加物种多样性、为其他生物提供生长区域、生活媒介和营养等功能[2-3]。藻类和沉水植物在淡水湖中非常常见，因此，它们之间的生态位重叠更频繁，关系更为密切[4]。两种物种之间既存在附生等协同作用，也可存在对碳源和营养盐的竞争作用，在竞争关系下，沉水植物往往具有获得优势的能力[5]。有研究证实一些沉水植物对微藻具有化感抑制作用[6]。沉水植物化感作用限制藻类的过度繁殖，是水生生态系统恢复的关键，作为淡水生态稳定和恢复物种的沉水植物将在水生生态系统的净化、稳定和正常化方面做出更多贡献[7]。

通过沉水植物抑制微藻生长已经取得了广泛的关注，闫志强等[8]研究了5种沉水植物及其种植水、浸提液对斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)的化感作用，其中共培养条件的抑藻效果最显著；杨琳[9]等在研究两种沉水植物的浸提液对斜生栅藻(S.obliquus) 的化感效应中，发现眼子菜的效果更好。在化感作用的研究中，为研究化感作用的强弱，实验往往通过共培养、种植水、浸提液等方式进行，且大多探究生物量、抑制率等基础指标，对微藻的逆境生理关注较少。因此，本文以淡水湖泊中常见的沉水植物箬叶藻(Potamogetonmalaianus)、金鱼藻(Ceratophyllumdemersum)，以及淡水水体生态常用指示生物斜生栅藻(S.obliquus)进行实验，拟通过测定微藻相关逆境指标，为上述沉水植物化感作用的效果评价、机理解释、生态学研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料及培养

受试植物斜生栅藻(S.obliquus)、箬叶藻(P.malaianus)、金鱼藻(C.demersum)均保管于山西农业大学分子农业与生物能源研究所。斜生栅藻采用BG11培养基pH 7.2±0.2培养于光强3000 lx、光暗比12 h∶12 h、温度25 ℃±1 ℃的光照箱中。沉水植物经蒸馏水冲洗去除杂质、5%次氯酸钠溶液消毒及漂洗后移入BG11培养基中，进行为期14 d的适应性培养, 培养条件均与斜生栅藻相同。

1.2 共培养实验设置

根据前人湖泊生态学沉水植物丰度的调查结果[10]，将沉水植物的生物量控制在4.0 g/L左右，即取箬叶藻、金鱼藻、金鱼藻+箬叶藻各3.0 g, 分别接种于含有750 mL 已灭菌BG11培养基的1 L三角瓶中，并接入斜生栅藻，初始接种量为2.8×105cells/mL，另取750 mL已灭菌 BG11培养基，接入密度为2.8×105cells/mL的斜生栅藻作为空白对照。共设4个处理，每个处理各重复3次。将三角瓶移至山西农业大学分子农业与生物能源研究所培养室进行培养(光强3000 lx, 光暗比12 h∶12 h，pH 7.2±0.2, 温度25 ℃±1 ℃), 每日随机调换各瓶位置，实验持续一周。

表1 BG11培养基的成分

1.3 栅藻生物量测定

栅藻生物量采用血球计数板法。每日17:00取100 μL混匀后的水样，经鲁格试剂固定后置于光学显微镜下进行细胞计数，每个处理重复3次。

1.4 栅藻生理指标的测定

1.4.1 栅藻叶绿素荧光观察

取藻样20 μL滴于载玻片上，小心加盖盖玻片，防止产生气泡，随后将玻片置于正置荧光显微镜(OLYMPUS, BX53),选择蓝光为激发光，在镜下观察并拍照。

1.4.2 栅藻叶绿素含量的测定

叶绿素含量测定参照Arnon等的方法[11]，取藻样8 mL, 10 000 r/min 离心10 min后将藻细胞重悬于5 mL 80% (V/V) 预冷丙酮中，石英砂研磨后将匀浆离心(10 000 r/min, 10 min, 4 ℃),取上清液，使用分光光度计测定645和663 nm处的吸光值，按照下式计算：

叶绿素b含量=总叶绿素含量-叶绿素a含量

公式中：A663为663 nm样品吸光值，A645为645 nm样品吸光值。

1.4.3 栅藻粗酶液的提取及抗氧化系统相关指标的测定

试验结束后收集藻类培养物样品(50 mL)，以4000 r/min离心20 min，弃去上清液。将收集的藻类转移到5 mL PBS缓冲溶液(pH 7.8)中，在4 ℃下用石英砂研磨，将研磨后的匀浆在4 ℃下以8000 r/min离心20 min。上清液用于测定CAT、SOD、POD、MDA等指标，CAT采用紫外分光光度法[12]，SOD采用氮蓝四唑法[13]，POD采用愈创木酚法[14]，MDA采用硫代巴比妥酸法[15]测定。

1.5 数据统计与分析

沉水植物对斜生栅藻的抑制率公式[16]如下：

公式中：Id为抑制率/(%)，N0为空白对照中的微藻生物量，N为处理组中的微藻生物量。

试验数据重复3次，试验结果使用SPSS13.0软件(SPSS Inc.), Tukey法分析试验结果在P<0.05水平上是否具有显著性差异，使用Origin8.0软件(OriginLab Inc.)绘制统计图。

2 结果与分析

2.1 两种沉水植物对斜生栅藻的生长抑制效应

两株沉水植物对斜生栅藻的细胞密度影响见图1。试验结果表明，两种沉水植物(金鱼藻、箬叶藻)及其混合种植对斜生栅藻的生长具有显著的抑制作用，随着培养周期的增加，微藻的细胞密度渐进性减少，在第6天时达到最低，与金鱼藻共培养的栅藻密度为0.44×105cells/mL, 与箬叶藻共培养的栅藻密度为0.42×105cells/mL, 而在沉水植物混合种植的条件下，微藻的生物量为0.66×105cells/mL；均显著低于空白对照组生物量(9.82×105cells/mL)。

沉水植物对斜生栅藻的抑制率也随着培养时间的延长而增加，并在第6天时达到最大，金鱼藻对藻类的抑制率达到95.5%，箬叶藻达到95.7%，混合组达到93.2%。第7天时，抑制率有所下降，微藻生物量有一定程度的恢复，但是仍然保持在极低水平(图1)。

2.2 两种沉水植物对斜生栅藻叶绿素含量的影响

采用荧光显微镜观察叶绿素自发荧光进行定性分析。如图2所示，空白对照组栅藻细胞在白光下清晰可见，颜色呈现深绿色，在蓝光激发下，细胞中的叶绿素自发橘红色荧光，荧光清晰、均匀，未见异常光点；在金鱼藻处理中，藻细胞颜色较浅，但尚可观察，蓝色激发光下表现出不均一的红色，掺加黄绿色光点；栅藻细胞在箬叶藻处理中较为透明，白光下若干细胞不可见，仅能在激发光下观察到亮度较高的绿色，形态不规整，样本以亮绿色居多；与箬叶藻处理相同，混合组内若干藻细胞在白光下不可见，激发光下表现出亮绿色，红色光较少。

图1 共培养条件下沉水植物对斜生栅藻的生长影响及抑制率

通过检测叶绿素a、b含量进行定量分析。如图3所示，与对照相比，各个处理均显著减少了斜生栅藻叶绿素a、b的含量(P<0.05)。在试验结束时，箬叶藻影响下的栅藻叶绿素含量仅相当于空白对照组的30%左右，在其余处理中，栅藻的叶绿素含量也有所下降，但均不如箬叶藻组明显。

图2 叶绿素自发荧光定性检测

2.3 斜生栅藻应对沉水植物化感作用的生理响应

斜生栅藻在沉水植物抑制时会产生生理应答，因此本实验测定了各处理中斜生栅藻抗氧化酶活、丙二醛和可溶性蛋白、可溶性多糖的影响。

2.3.1 沉水植物对斜生栅藻抗氧化系统的影响

过氧化氢酶活性是衡量细胞清除过氧化氢能力的重要指标。在沉水植物组中，CAT显著增高，与对照相比，最高增加了57.4%(箬叶藻组)。丙二醛通常用来反映细胞膜脂过氧化程度。3组处理均显著提高了栅藻细胞丙二醛的含量(P<0.05)。与空白对照相比，金鱼藻组、混合组分别提高了88.3%、89.3%的丙二醛，而箬叶藻组相对增加较少，约为83.3%。

过氧化物酶是细胞抗氧化系统的重要酶，一定程度上反映衰老程度。与先前的指标类似，其在沉水植物影响下显著增高；不同的是，超氧化物歧化酶活性增加不明显，各个处理间差异不太显著。

图4 沉水植物对斜生栅藻抗氧化系统的影响

2.3.2 沉水植物对斜生栅藻可溶性蛋白、可溶性糖的影响

可溶性蛋白质和糖含量如图5所示。沉水植物抑制了斜生栅藻的蛋白质含量(柱状图)，各处理均低于对照(P<0.05)，但糖合成受到刺激，可溶性糖含量增多。

图5 沉水植物对栅藻可溶性蛋白、可溶性多糖含量的影响

3 讨论

沉水植物通过分泌化学物质抑制同一环境内微生物藻类的生长，这似乎可以作为控制水体藻类数量的方法，但是沉水植物的种类、生物量等条件都会影响对藻类的化感作用[17]。本研究通过参考淡水湖泊中沉水植物的最大生物量设置浓度，选择了两种常见的沉水植物(金鱼藻、箬叶藻)，以及淡水环境常用指示藻种(斜生栅藻)作为供试材料，在相对自然的生物量条件下进行实验，探究沉水植物化感作用对斜生栅藻的影响。通过实验发现，金鱼藻、箬叶藻及其混合培养，都会对斜生栅藻的生长产生明显的抑制作用，并持续较长时间，这与先前的诸多报道基本相似；在共生条件下，微藻生长势的抑制可能是由于营养元素的缺失或者沉水植物遮挡光照而引起的，然而，根据Wu等[18]的研究，营养盐竞争、影响光照等因素均可以排除。

另外，在第7天时，微藻的生物量呈现一定程度的恢复趋势，推测生物量的恢复与沉水植物分泌的化感物质的挥发或者分解有关[19]，因其多为有机酸、挥发油和酚类[20-21]。

在生理学层面上，藻类可以对化感抑制做出反应，其光合系统、抗氧化防御系统和膜脂质过氧化都会发生一系列变化。测定逆境生理学指标有助于明确化感物质抑制藻类的机理，然而，现有的大部分研究大多着重于测定微藻生物量等基础指标，对逆境指标测定甚少。

叶绿素是藻类光合作用的物质基础[22]。在本研究中，与沉水植物共培养时藻类叶绿素浓度降低，叶绿素自发荧光变弱，可能是因为化感物质导致微藻叶绿素的降解，这证明栅藻光合系统的损伤。

抗氧化酶活性通常用来衡量活性氧积累和细胞的抗氧化能力。通常情况下，ROS在以POD、CAT和SOD等酶组成的抗氧化系统作用下稳定代谢[23]。在本研究中，POD、CAT等抗氧化酶含量升高，以缓解化感抑制下的ROS积累；SOD的含量变化不明显，可能是因为SOD的合成结构遭到破坏，导致SOD的活力下降，因此CAT和POD的含量维持高水平用以对抗活性氧迸发，植物细胞的抗氧化防御系统具有多种抗氧化酶，其中各个酶的关系和反应先后仍需进一步研究。膜脂过氧化程度通常用MDA衡量，本实验中，SOD的活性下降，抗氧化防御效率降低，自由基紊乱，膜脂过氧化加剧，因而MDA含量增加[24]。

不同处理的可溶性蛋白含量下降，可能是在化感物质胁迫下，藻细胞蛋白质合成机制被破坏，另一方面，随着抗氧化系统效率变低，过量的ROS阻碍了酶的合成机制，因此导致了总蛋白的缺失[25]。相反，可溶性总糖含量显著增加，猜测是藻细胞为了去除过量的ROS而产生具有抗氧化功能的糖，Li等[26]的研究证明一种念珠藻可以分泌具有抗氧化功能的糖，可以增强抗氧化活性。总之，沉水植物可以通过产生特异性的抑制微藻生长、光合作用及抗氧化酶系统的化学物质，从而在竞争中取得优势。

4 结论

现阶段微藻虽已在实际生产中大规模引用，例如生物质生产、污水处理等生物技术产业[27]，但是自然水体中微藻的暴发往往会导致水生态系统的崩溃。生物控藻、杀藻等技术愈来愈重要，与传统化学杀藻剂相比也更符合绿色生态平衡的理念，因此基于化感作用的控藻技术得到了较多生态学工作者的关注。在本研究中，发现传统沉水植物在共培条件下均可抑制斜生栅藻的生长，并对其抗氧化系统和光合系统造成较大损害，为后续化感作用抑制微藻的分子机理奠定了生理学基础。