抑制型离子色谱法电导检测畜禽肉中硝酸盐和亚硝酸盐

孙延勤，张芳芳，沈娟，吴欣怡，李春保，陈颖，王玮*

1(南京农业大学 食品科技学院，江苏 南京，210095) 2(国家肉品质量安全控制工程技术研究中心(南京农业大学)，江苏 南京，210095) 3(农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心(南京农业大学)，江苏 南京，210095) 4(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海,201206) 5(中国检验检疫科学研究院，北京,100176)

硝酸盐和亚硝酸盐可作为护色剂和防腐剂被添加到肉制品中，有助于改善肉色，抑制微生物的生长和繁殖，延长肉制品的货架期[1]。但亚硝酸盐会将人体的血红蛋白转化为高铁血红蛋白，使血液失去携氧功能，并且具有致癌、致畸作用，过量甚至危及生命[2-6]。

当前有效的检测方法GB 5009.33—2016前处理操作较繁琐，耗时较长，精密度差，回收率偏低。为此，本试验通过优化前处理方法和仪器检测条件，建立一种可同时检测畜禽肉及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐含量的抑制型离子色谱法。该方法在前处理时采用二氯甲烷和Na柱，可有效降低有机物和金属离子等杂质对硝酸盐和亚硝酸盐检测的干扰，弥补国标方法检测的缺陷，旨在为我国肉类及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐的快速检测提供可靠的科学依据和坚实的技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

供试材料包括各种畜禽肉及其制品，如猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、腌腊肉制品、肉干制品、西式肉制品等样品，南京农贸市场和超市。

1.1.2 试剂

硝酸盐标准液、亚硝酸盐标准液(均为200 mg/kg，以各硝酸根离子浓度计)，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；二氯甲烷、甲醇、KOH(均为分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。所有溶液均采用超纯去离子水配制。

1.2 仪器与设备

ICS5000型离子色谱仪(配有电导检测器，AERS型抑制器，CR-TC捕获柱)、RP柱和Na柱，美国Thermo Fisher公司；D-16C高速冷冻离心机、CPA224S分析天平，德国Sartorius公司；TW20水浴锅,德国JULABO公司；X025-12DTD超声波清洗器，南京先欧仪器公司；各种量程微量移液器，德国Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的前处理

1.3.1.1 自建方法

称取2 g均质样品(精确至0.000 1 g)，置于50 mL离心管中，加入30 mL超纯水，40 ℃超声萃取30 min，每隔5 min振摇1次；75 ℃水浴加热5 min，取出后冷却至室温，加入10 mL二氯甲烷，摇晃、分层、静置，5 000 r/min离心10 min；取上清液依次过0.22 μm滤膜、RP柱和Na柱，弃去前3 mL上清液，待上机检测。除不称取样品外，按照上述操作同时完成对应的空白对照实验。

1.3.1.2 国标方法[20]

按照《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》(GB 5009.33—2016)中第一法规定的前处理方法，委托农业农村部肉及肉制品质量监督检验测试中心(南京)进行操作。

1.3.2 过滤柱活化

过滤柱和滤膜萃取使用前需要进行活化，其活化过程为：RP柱依次用5 mL甲醇、10 mL超纯水通过，静置活化30 min；0.22 μm滤膜用10 mL超纯水通过，静置活化30 min。

1.3.3 色谱条件的建立

使用Dionex IonPacTMAS11-HC RFICTMAnalytical型离子色谱分析柱(4 mm×250 mm)，配备Dionex IonPacTMAG11-HC RFICTMGuard型保护柱(4 mm×50 mm)。检测条件为：柱温30 ℃；抑制器电流149 mA；流速1.0 mL/min；进样量100 μL；KOH淋洗液，淋洗条件见表1。

表1 梯度淋洗条件Table 1 The conditions of eluting solution

1.3.4 标准曲线的制作及检出限、定量限的确定

根据以上试验确定的最佳检测条件，将硝酸盐、亚硝酸盐配制成系列浓度混合标准工作溶液，其中硝酸根离子浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/kg，亚硝酸根离子浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2 mg/kg，上机检测。以硝酸根及亚硝酸根离子质量浓度(mg/kg)为横坐标(X)，峰面积(μS×min)为纵坐标(Y)绘制标准曲线，以此确定最佳线性范围以及相关系数。本试验以3倍信噪比计算检测限(limit of detection, LOD)，10倍信噪比计算定量限(limit of quantitation, LOQ)。

1.3.5 精密度和加标回收率实验

将猪、牛、羊、鸡、鸭5种畜禽肉搅碎后，分别添加低、中、高3个浓度水平的硝酸盐及亚硝酸盐的混合标准溶液。按1.3.1节方法进行前处理，对同一浓度的标准样品重复进样6次，计算其加标回收率和精密度。

1.3.6 方法的实际应用

选取市售畜禽肉制品14份，其中腌腊肉制品4份、酱卤制品3份、肉干制品3份、烧烤制品1份、西式肉制品3份，其样品前处理方法和检测条件参照1.3.1、1.3.2和1.3.3节方法，以此评价该方法的实际应用效果。

1.4 数据分析

使用美国Thermo Fisher Scientific公司的Chromeleon Client Program程序软件分析数据，使用Microcal Origin 7.5(Microcal Software公司)软件制图。加标回收实验平行测定6次，计算其RSD；样品平行测定3次，计算其平均值。

2 结果与分析

2.1 检出限、定量限和线性范围

硝酸盐和亚硝酸盐的标准品色谱图见图1，绘制标准曲线，以此来确定硝酸盐及亚硝酸盐的定量限、检出限和线性范围。由图1和表2可知，硝酸盐和亚硝酸盐的分离度较好，定量限分别为0.3、0.2 mg/kg，检出限分别为0.09、0.06 mg/kg。硝酸盐在0.2～2.0 mg/kg，亚硝酸盐在0.02～0.2 mg/kg范围内均呈良好的线性关系，其相关系数均为0.999。

图1 硝酸盐及亚硝酸盐的离子色谱图Fig.1 Ion chromatogram of nitrate and nitrite

表2 硝酸盐及亚硝酸盐的线性方程、线性系数、检出限及定量限Table 2 Linear equation, linear coefficient, quantitative limit and detection limit of nitrate and nitrite

2.2 加标回收率及精密度

由于自建和国标方法检测畜禽肉中硝酸盐和亚硝酸盐的本底值不同，本试验依据各样品的本底值分别计算其加标量(表3)。分别对猪、牛、羊、鸡和鸭5种畜禽肉进行回收率的检测，结果如表3所示，在低、中、高3个浓度水平，自建方法所测得硝酸盐和亚硝酸盐的加标回收率平均值分别在77.0%～106.1%、77.3%～101.0%、65%～97.5%、80.0%～103.3%、90.5%～99.2%，精密度分别在1.12%～8.75%、2.48%～7.05%、1.34%～6.83%、1.29%～7.70%、0.10%～8.20%。而国标方法所测得硝酸盐和亚硝酸盐的加标回收率平均值分别在30.8%～76.8%、16.7%～83.0%、51.7%～89.2%、25.4%～63.0%、50.3%～80.0%，精密度分别在1.82%～10.40%、1.02%～12.26%、2.41%～13.34%、1.14%～11.49%、2.36%～13.01%。这表明自建方法的回收率较高，精密度良好。

表3 自建与国标方法加标回收率和精密度比较(n=6)Table 3 Comparison of recovery and precision between improved method and GB (n=6)

2.3 方法的实际应用

为评价自建方法的实际应用效果，选取市售畜禽肉制品为研究对象，检测其中的硝酸盐及亚硝酸盐结果如表4所示。选取的市售肉制品都含有一定量的硝酸盐和亚硝酸盐。硝酸盐含量在0.518 9～37.062 9 mg/kg，其中仅有猪肉脯含量高于国家限定最大残留量(30 mg/kg)。此外，酱牛肉、肉松和烤鸭中硝酸盐含量也有检出，但均未超标。亚硝酸盐含量在0.046 8～10.693 4 mg/kg，其中无淀粉火腿含量最高，但低于国家限定最大残留量(30 mg/kg)。

表4 畜禽肉制品中硝酸盐及亚硝酸盐含量Table 4 Contents of nitrate and nitrite in livestock andpoultry products

续表4

序号样品名称检测值/(mg·kg-1) NO-3NO-29五香味牛肉干0.518 90.046 810香酥肉松23.649 20.350 811烤鸭17.767 90.174 512烤肠1.427 07.199 913无淀粉火腿9.748 310.693 414烧烤风味培根7.422 81.302 9

3 结论与讨论

离子色谱法因其操作简便、回收率稳定，常被广泛应用于肉制品的检测[21-22]。本试验改进现行有效检测方法《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》(GB 5009.33—2016)的前处理方法和色谱分析条件，建立的抑制型离子色谱法分离度良好，硝酸盐和亚硝酸盐的定量限和检出限低于国标规定的值，并分别在0.2～2.0、0.02～0.2 mg/kg浓度范围内呈良好线性关系。

本试验建立5种畜禽肉的检测方法，与国标方法相比，回收率高、精密度良好。究其原因可能是国标方法在前处理时用滤纸过滤提取液，滤纸的使用会严重干扰硝酸盐和亚硝酸盐的检测结果[23]。较之国标和其他文献报道[1,4-6,8-10,22-23]，本试验在前处理时加入二氯甲烷，可有效萃取畜禽肉制品中脂肪、蛋白质等有机物，从而避免其污染色谱柱，降低柱效和干扰检测结果[24-25]。此外，二氯甲烷低毒且价格便宜，容易去除。在检测时还发现，国标方法检测鸡肉的回收率偏低，究其原因可能是鸡肉样品基质复杂，低浓度的检测物质易被干扰[26]。

在对市售畜禽肉制品抽样检测结果显示，待测样品中都含有一定量的硝酸盐和亚硝酸盐，其中亚硝酸盐含量均未超标。而猪肉脯中硝酸盐含量为37.062 9 mg/kg，高于国家限定最大残留量(30 mg/kg)。究其原因可能是生产者为增强消费者的购买欲，在加工过程中过量加入硝酸盐和亚硝酸盐，使成品形成鲜艳的棕红色[27]。

本试验建立一种可同时检测畜禽肉及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐含量的抑制型离子色谱法，该方法操作简单、试验周期短、回收率较高、精密度良好，适用于肉类及其制品中硝酸盐和亚硝酸盐的快速测定。