姜黄素对动脉粥样硬化大鼠血液中炎症因子与血脂的影响及其作用机制

潘海龙 何兴强2 成娅 李栋 齐元杰 姚来昱 沃金善

(1 青岛大学附属医院心内科，山东 青岛 266003； 2 陕西中医药大学第二附属医院心内科)

动脉粥样硬化(AS)是一种以动脉血管内壁脂质堆积、慢性炎症反应、细胞死亡和纤维化等为病理特征的常见疾病，严重危害着人类的健康[1-4]。大量研究证明，强化调脂可以显著降低血管壁的炎症反应、延缓AS的病程，甚至能够逆转其进展。但强化调脂治疗患者依从性差，其带来的严重的副作用如肌溶解、严重肝功能损害等亦不能忽视。目前已有研究表明一些中药提取物能够显著降低血脂以及抑制血管壁炎症反应，在抗AS方面可能发挥着重要作用[5-7]。因此，以现代医学的方法探寻中医药抗AS的作用及机制有着广阔的前景。姜黄素是姜科植物姜黄的主要成分，现有的研究表明，其毒副作用及不良反应较小，且具有广泛的抗纤维化、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，目前已被应用于多种疾病的临床和基础研究[8-10]。但目前姜黄素抗AS的具体作用及机制尚不明确。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是哺乳动物细胞内主要的细胞信号通路之一，在调控细胞增殖、发育、代谢等方面发挥着重要作用。研究表明，PI3K/Akt信号通路激活能够促进多种炎症因子的表达及AS的发生[11-13]。因此，本研究旨在探讨姜黄素对AS模型大鼠AS的作用及对PI3K/Akt信号通路的影响，为AS的治疗提供新的选择及理论依据。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

健康雄性SD大鼠72只，体质量(200±20) g，购于青岛康大生物科技有限公司，合格证号：SCXK(鲁)20160002。姜黄素购自西安圣青生物科技有限公司，辛伐他汀片购自美国默沙东制药有限公司。

1.2 主要仪器与试剂

RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、Realtime-PCR试剂盒购自日本Takara公司。蛋白提取试剂盒、电泳液、转膜液、PVDF膜、SDS-PAGE预制胶(10%)、超敏ECL化学发光试剂盒、抗体稀释液、HE染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，GAPDH、PI3K、Akt一抗购自美国CST公司，二抗购自日本Abcam公司。大鼠TG、LDL、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司。Realtime-PCR仪、酶标仪购自美国Bio-Rad公司，倒置显微镜购自日本Nikon公司。

1.3 实验方法

1.3.1分组及动物模型制备SD大鼠随机均分为空白对照组(K组)，AS模型对照组(M组)、辛伐他汀阳性组(Y组)、姜黄素高剂量组(G组)、中剂量组(Z组)和低剂量组(D组)，每组12只大鼠。大鼠标记并适应性饲养1周后，除K组(普通饲料喂养)外，其余5组给予高脂饲料喂养12周制备AS模型。造模成功后，进行4周药物干预治疗。K组和M组给予生理盐水灌胃，Y组给予辛伐他汀(4 mg/kg)灌胃，G、Z、D组分别给予300、200、100 mg/kg姜黄素灌胃，每日1次，共4周。

1.3.2血清血脂及炎性因子的检测 药物干预完成后，取各组SD大鼠，麻醉后打开腹腔，经腹主动脉抽取动脉血5～10 mL，离心后收集上清液。采用ELISA法检测各组血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)以及低密度脂蛋白(LDL)水平。按照试剂盒说明书步骤进行操作。

1.3.3主动脉组织的病理学检测 取各组SD大鼠主动脉组织，置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定，脱水、包埋，5 μm厚切片，行HE染色，观察组织病理学的变化。

1.3.4免疫印迹法检测大鼠主动脉组织PI3K、Akt蛋白的表达 取各组SD大鼠主动脉组织，提取总蛋白，测总蛋白浓度。取40 μg蛋白样品行凝胶电泳，电泳结束后转膜至PVDF膜；室温下，脱脂牛奶封闭1 h后，一抗(GAPDH、PI3K、Akt)孵育2 h，TBST洗涤后二抗孵育1 h，经TBST漂洗后采用化学发光法显影成像。采用Quantity One 4.4测量灰度值计算PI3K、Akt蛋白表达量。

1.3.5Realtime-PCR方法检测大鼠主动脉组织中PI3K、AktmRNA的表达 提取各组SD大鼠主动脉组织中总RNA，逆转录后按照试剂盒说明步骤行Realtime-PCR检测。采用Gapdh为内参照，以2-△△CT法计算PI3K、AktmRNA的相对表达量。PI3K上游引物：5′-AGATCGCTCTGGCCTCATTG-3′,PI3K下游引物：5′-AGCCAGTTCAGAAG-GGCATC-3′；Akt上游引物:5′-TCAA AGAAGTCAAAGGGGCTGC-3′,Akt下游引物:5′-CTCCTTCACAATAGCCACGTC-3′；Gapdh上游引物：5′-TGAAGGTCGGAGTGAACGGATT-3′，Gapdh下游引物：5′-CGCCCTTTTTACCTTGGATAGT-3′。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组血清中IL-6、TNF-α、TC、TG、LDL水平比较

单因素方差分析结果显示，6组大鼠血清中 IL-6、TNF-α水平比较差异均具有显著性(F=56.40、65.40，P<0.01)，两两比较结果显示除M组与D组的IL-6差异无显著性外，其他任意两组间差异均有显著性(P<0.05)； 6组血清中TC、TG、LDL水平比较差异有显著性(F=39.66～54.60，P<0.01)，两两比较的结果显示除M组与D组、Y组与G 组、G组与Z组TC；M组与D组、G组与Z组TG；K组与Y组、G组与Z组LDL差异无统计学意义外，其他任意两组间差异均有显著性(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清中TC、TG、LDL、TNF-α、IL-6水平变化

2.2 大鼠主动脉组织病理学变化

HE染色显示，K组大鼠主动脉组织光滑完整，未见明显炎性细胞浸润；M组大鼠主动脉组织内可见大量炎性细胞、泡沫样细胞浸润及明显增殖的平滑肌细胞，并出现散在钙化灶；Y组大鼠主动脉组织中炎性细胞、泡沫样细胞显著减少；与K组相比，G、Z、D组大鼠主动脉组织中仍可见炎性细胞、泡沫样细胞浸润及增殖的平滑肌细胞，但同M组相比上述病理改变均得到了显著缓解，G、Z组缓解效果较为明显。

2.3 各组大鼠主动脉组织中PI3K、Akt蛋白以及mRNA的表达

单因素方差分析结果显示，6组大鼠主动脉组织中PI3K、AktmRNA表达水平差异具有统计学意义(F=2 930.20、2 874.12，P<0.01)，两组间比较差异均具有显著性(P<0.05)；6组大鼠主动脉组织中PI3K、Akt蛋白表达水平差异均具有统计学意义(F=878.68、297.83，P<0.01)，两组间比较差异均具有显著性(P<0.05)。见表2。

组别Akt mRNAAkt蛋白PI3K mRNAPI3K蛋白K组1.28±0.070.97±0.010.98±0.040.76±0.01M组7.63±0.291.61±0.0510.88±0.131.75±0.04Y组2.49±0.080.83±0.011.68±0.111.20±0.01G组3.61±0.111.01±0.042.47±0.121.30±0.07Z组5.47±0.161.05±0.033.40±0.351.50±0.09D组7.30±0.181.35±0.044.92±0.401.57±0.12

3 讨 论

研究表明，姜黄素能够通过有效调节多种生物过程和通路而发挥对相关疾病的治疗作用[14]。在动物模型和临床试验中进行的研究表明，即使在高剂量下，姜黄素仍具有很好的安全性，其耐受性和无毒性也已得到公认，并且不会对肝和肾功能造成任何不良影响[15-17]。姜黄素具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、免疫调节、抗增殖、促凋亡、抗损伤、抗寄生虫及抗疟疾等。研究表明，姜黄素在癌症、糖尿病、系统性红斑狼疮以及肝脏、神经系统疾病的预防和治疗中也起到了良好作用[18-19]。

研究认为炎症反应作为AS的核心贯穿于AS的整个过程，炎症细胞是AS的主要执行者，炎症递质是AS的关键分子。在AS早期，细胞炎症因子、急性期反应蛋白表达升高，进而造成血管内皮功能紊乱、平滑肌增殖及微血管重塑等，最终导致斑块破裂及血栓形成[20-22]。研究发现，内皮细胞功能异常时会导致细胞炎症因子IL-6以及TNF-α的异常分泌[23-25]。IL-6可通过增强炎症反应及凝血功能，促进内皮细胞不断增生，从而介导AS斑块的形成，并进一步促使不稳定斑块形成。TNF-α可在内皮细胞作用下，直接参与炎症反应，导致大量细胞受损脱落，加速AS形成和进展。本研究结果显示，同K组相比，M组血清IL-6及TNF-α表达水平显著升高，M组和G、Z、D组血清中IL-6及TNF-α表达水平均显著下降，且姜黄素组血清IL-6及TNF-α的表达水平与姜黄素剂量呈浓度依耐性下降。以上结果提示姜黄素能够显著降低AS组织IL-6和TNF-α的分泌，其过程可能与其使炎症反应受到抑制有关。有研究认为脂质代谢紊乱与AS发生发展密切相关，LDL等会导致脂蛋白在血管内膜下聚集而形成泡沫细胞，进而引起血管壁的慢性炎症反应，而泡沫细胞的凋亡可进一步使促炎因子释放，最终加速AS的进展[26]。本研究结果显示，同K组相比，M组血清中TC、TG与LDL水平均显著升高，而在Y组和G、Z、D组明显下降，且在姜黄素组中以G组下降最明显。结果说明，姜黄素能够明显降低AS模型动物血脂水平，提示其有可以作为降脂类药物的有效补充。主动脉组织病理结果提示姜黄素能够显著降低AS血管内炎性细胞、泡沫样细胞浸润及平滑肌细胞增殖。以上实验结果说明姜黄素有着很好的控制炎症及降低血脂作用，可能作为治疗AS的有效潜在药物。

PI3K/Akt信号通路是AS发生发展的重要生物学通路，并在许多心血管疾病中得到证实，其可参与调节细胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖转运等过程。PI3K可被多种信号分子激活，而导致其下游靶分子Akt磷酸化。PI3K/Akt信号通路的激活可加速炎症反应和AS的发展，而抑制PI3K/Akt信号通路可改善AS的进展[27-29]。本研究结果显示，同K组相比，M组主动脉组织中的PI3K、Akt蛋白及mRNA表达水平显著升高，Y组表达显著下降，G、Z、D组主动脉组织中PI3K、Akt蛋白及mRNA水平的表达均受到明显抑制，姜黄素组中以G组抑制最为明显。以上结果表明，姜黄素能够显著抑制AS主动脉血管中PI3K、Akt的表达，可能为姜黄素抗AS的作用机制。

综上所述，本研究结果显示，姜黄素能够显著抑制AS模型大鼠主动脉组织中炎症因子IL-6、TNF-α的生成及降低血清TC、TG及LDL水平，减少主动脉炎性浸润及降低脂质成分的堆积，显示出良好的抗AS效果；并且能够降低PI3K、Akt蛋白以及mRNA的表达。姜黄素可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路而发挥抗AS作用，可能作为AS预防和治疗的潜在药物，但其完整的信号通路机制，仍需进一步完善研究。