神经复元方对原代大鼠海马神经元BDNF/TrKB信号通路影响的研究*

蔡 丽，董耀荣，李文涛，刘 毅

上海中医药大学附属市中医医院(上海 200071)

卒中后抑郁(Post-stroke depression,PSD)是与脑卒中事件相关、临床表现为抑郁心境的情感障碍性疾病。属中医学“中风病”、“郁证”范畴，属于“因病致郁”两者合病而成。目前很多研究者认为该病由于脏腑功能失调，或气血不足，在内伤积损的基础上，复因外邪、情志、饮食等而诱发，导致气血运行不畅，气滞痰阻，瘀血内生，痰热内蕴，或肝阳化风、血随气逆，导致脑脉痹阻或血溢脉外而发中风。中风后气血逆乱，上冲于脑，加之情志不舒，肝气郁滞，痰瘀互阻而致郁。多项临床研究表明中医药治疗PSD，包括中药治疗、中成药等治疗手段，可以因人因时因地辨证论治，个体化的治疗方案针对性强，除了可以改善患者抑郁症状外，还可以改善患者的中医其他症候，疗效明确，副作用较小，有一定优势。前期研究证实神经复元方对改善卒中后抑郁患者抑郁症状有较好疗效[1-2]，但对其发挥作用的分子机制尚无研究。有研究发现脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic facto，BDNF)水平与PSD具有相关性[3-4]。本实验引入BDNF/TrkB通路抑制剂(K252a)，探讨神经复元方是否通过介导BDNF-TrkB信号通路发挥抗抑郁作用，为本方分子机制打下一定基础。

材料与方法

1 材 料

1.1 动物：清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，3个月龄，体重(210±30)g，上海实验动物研究中心提供，在标准实验环境中饲养。出生1 d的SD新生鼠，由上海实验动物研究中心提供。所有实验操作经上海市中医医院医学伦理委员会批准并指导进行，尽量减轻动物的痛苦。

1.2 主要实验用试剂：神经复元方药剂，采用单味中药配方颗粒冲调而成，由江苏省江阴市天江药业有限公司生产提供、MEM培养基、BDNF 免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、木瓜蛋白酶溶液、脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)、BCA蛋白浓度测定试剂盒及RIPA裂解液、电泳液、丽春红、脱脂奶粉、转膜液、氯仿、异丙醇等。

2 实验方法

2.1 含药血清的制备：制备大鼠正常血清和神经复元方含药血清。选取SD大鼠12只，随机分为正常对照组和神经复元方组，各6只。神经复元方组每次按照1 ml/100 g的神经复元方灌胃，每日两次，连灌7 d，第7天给药后2 h腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，离心，分离血清，灭活(紫外线消毒法)、抽滤、冻存。

2.2 原代大鼠海马神经元的培养：选取新生1 d的SD大鼠，从胎鼠中分离出全脑。使用两对精细镊子在立体显微镜下从大脑中解剖大约20个海马，小心地从海马体中移除脑膜。将所有胎鼠和组织保持在最小必需培养基(Minimal essential medium，MEM)中并在冰上冷却。除孵育和离心外的所有后续步骤均在层流罩中进行。解剖后，将海马用7～8 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)在15 ml锥形管中轻轻洗涤3次。洗涤后，将5 ml木瓜蛋白酶溶液和20～60 μl脱氧核糖核酸酶I(DNase I)加入到管中海马中，然后将其在32℃下孵育12 min。孵育并用酶消化后，使用巴斯德玻璃吸管缓慢吸移海马12次，然后用湿润细胞过滤器(40-μmmesh，BD Biosciences)过滤到50 ml锥形管中。预先将细胞过滤器用10 ml含有20%FBS和1%N2补充物(100×,Invitrogen,Life technologies)的MEM润湿，以防止非特异性神经元细胞附着。将整个海马悬浮液倒入细胞过滤器中，然后将10 ml，20%FBS/N2/MEM倒在上面以收集残留在过滤器上的神经元。轻轻摇动总体积25 ml的混合液使酶失活，放置1 min，然后以180×g离心10 min。接下来，吸出上清液，将沉淀物以3×104个细胞/ml的恒定细胞密度重悬于培养基中。随后，将细胞悬浮液以每孔1 ml的体积接种到12孔板孔中。每个孔预先用0.5 ml的25% PuraMatrix制备，轻轻地进行电镀。以这种方式制备的大鼠胚胎海马神经元放置在37℃以下，含5%，CO2和95%空气的培养箱培养。24 h后以无血清培养基全量换液，此后每3 d换液1/3。3 d后加浓度为5×10-6mmol/L的阿糖胞昔，抑制神经胶质细胞增殖。将大鼠海马神经元原代培养到第7天，经NSE染色鉴定纯度。

2.3 药物血清毒性试验及最佳浓度：设空白对照组(正常血清)和不同浓度的中药血清组，将各组中药血清分别按2.5%、5%、7.5%、10%、15%的血清浓度和正常培养基相混合，与原代海马神经元细胞进行培养，每组4皿，分别于24 h、72 h后收集细胞，采用MTT法观察不同浓度药物血清对原代海马神经元细胞增殖的影响，以确定无毒剂量及最佳含药血清浓度。

2.4 细胞分组及干预：海马神经元原代培养第7天，进行实验分组。正常对照组：在培养液中孵育3 h后，更换含空白血清培养液继续孵育48 h。H2O2培养组：在培养液中孵育3 h后，更换100 μmol/L，H2O2培养液继续孵育48 h。含药血清(Serum)+ H2O2培养组：含药血清预处理1 h，再加入100 μmol/L ，H2O2培养液继续孵育48 h。含药血清(Serum)+K252a+ H2O2组：含药血清预处理1 h，再加入BDNF/TrkB通路抑制剂K252a(K252a又分为100、200、400 nmol/L ，3个剂量)及100 μmol/L H2O2培养液继续孵育48 h。K252a+ H2O2组：含药血清预处理1 h，再加入BDNF/TrkB通路抑制剂K252a(K252a又分为100、200、400 nmol/L 3个剂量)及100μmol/L， H2O2培养液继续孵育48 h。每组5个复孔，收集细胞进行检测。K252a为BDNF/TrkB信号通路抑制剂；H2O2浓度为100 μmol/L。

2.5 透射电镜观察：用透射电镜测量海马神经元突触界面结构参数，包括突触界面曲率、突触活性区长度与突触后致密物厚度、突触间隙宽度[5]。

2.6 实时荧光定量PCR检测：采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测突触生长相关蛋白-43(GAP-43)、突触蛋白(SYN I和SYNA)的mRNA基因表达水平。主要步骤参考文献[6]，分为Total RNA的提取和鉴定、cDNA合成和定量PCR反应，最后经过上机扩增检测，利用2-ΔΔct法计算。

2.7 Western-Blot检测：采用Western-Blot实验进行蛋白质印迹分析，测定海马神经元突触相关蛋白SYN I、SYNA和突触生长相关蛋白-43(GAP-43)的表达水平。主要实验步骤参考文献[6]。

3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料用t检验，计数资料用χ2检验，P<0.05为有统计学差异。

结 果

1 透射电镜观察结果 与对照组比较，H2O2组的突触密度降低，提示H2O2引发氧化应激，诱导损伤海马神经元；H2O2加入含药血清(Serum)组突触密度增大，突触后致密物厚度增厚(H2O2+Serum组)，提示神经复元方可以有效修复H2O2对神经元的损伤作用；当同时加入含药血清和BDNF/TrkB信号通路阻断剂K252a后，神经元突触密度降低，突触后致密物厚度变薄，神经元损伤修复效果减弱(H2O2+K252a+Serum组)，提示K252a阻断BDNF/TrkB信号通路起到效果(图1)。

2 实时荧光定量检测 检测各组对突触相关蛋白SYNA、GAP-43和SYN1的mRNA表达影响(图2)。H2O2组、K252a+ H2O2组、含药血清+ K252a+ H2O2组的SYNA、GAP-43和SYN1 mRNA水平低于对照组和含药血清+ H2O2培养组(P<0.01)。与对照组比较，含药血清+H2O2培养组三项mRNA表达水平差异无统计学意义。提示，H2O2可损伤突触相关蛋白基因作用，加入神经复元方的血清可以有效修复这种损伤，若加入K252a阻断了BDNF/TrKB信号传导通路则药物作用受到抑制。

图1 培养细胞神经元TEM超微结构(×10000)

图2 各组SYNA、GAP-43、SYNI的mRNA表达水平比较(★P<0.05，★★P<0.01)

3 蛋白质印迹分析结果 定量测定和比较海马神经元中突触相关蛋白SYNA、GAP-43和SYN I的表达水平，结果见图3、4。H2O2组、K252a+H2O2组、含药血清+ K252a+ H2O2组的SYNA、GAP-43及SYN I蛋白表达水平明显低于对照组和含药血清+H2O2组(P<0.01)；与对照组比较，含药血清+H2O2培养组突触相关蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。提示，H2O2可损伤神经元突触相关蛋白表达，加入神经复元方的血清可以有效修复这种损伤，若加入K252a阻断了BDNF/TrKB信号传导通路则抑制了药物的修复作用。

图3 Western blot检测的各组神经元相关蛋白灰度分析

图4 各组SYNA、GAP-43、SYNI蛋白表达水平

讨 论

PSD是发生在卒中后的一系列郁证的表现，属本虚标实之证，病位多责之于脑，发病多涉及心、肝、脾、肾等诸脏，与风、痰、瘀、虚有关，治疗当滋心补肾，同时疏肝利气、化痰祛瘀、健脾养心。近年来，多项研究证实中医药治疗PSD临床疗效较好[7]，可以增加PSD大鼠5-HT的含量[8]。神经复元方源于名老中医李如奎教授的临床验方，在临床应用治疗中风后遗症及卒中后抑郁长达15年之久，可以有效改善PSD患者神经功能缺损及抑郁状态。

文献研究证实，BDNF与其特异性受体TrkB结合形成BDNF-TrkB 信号通路，在神经活动的刺激下参与神经元细胞的存活和生长发育，调节神经兴奋性[9]。TrkB酪氨酸磷酸化是整个信号传递系统的启动程序。其生物学效应的发挥，是在BDNF与TrkB 结合后，主要经由癌基因Ras编码的Ras蛋白通路实现信号转导反应，使神经元免受谷氨酸的毒性作用，同时能激活MAPK及PI3K信号通路。MAPK通路激活可促进神经生存，增加突触可塑性和神经再生，而PI3K通路不仅可以发挥促存活效应，还能对幼稚神经元的建立及神经元的迁徙起重要作用。多项研究发现其与PSD相关，Luo L等[10]的研究发现慢性抗抑郁药物对缺乏TrkB受体的PSD模型大鼠无明显疗效。同时Lawlor-Savage L等[11]的研究亦发现在PSD模型大鼠中过表达TrkB受体，能够起到类似抗抑郁的作用。Su Q等[12]研究发现在PSD模型大鼠海马区域直接注入BDNF可以起到抗抑郁作用，并对海马区神经元的增殖和分化具有促进作用。在2018欧洲精神神经药理学会(ECNP)年会上，著名神经生物学专家Eero Castren博士报道，BNDF-TrkB信号通路，在神经活动的刺激下与神经突触晚期长时程增强相互影响，从而在调节神经元存活及神经突触可塑性上发挥着重要作用。

因此，我们推测神经复元方是通过介导BDNF-TrkB信号通路发挥抗抑郁治疗作用，该信号通路是海马神经重塑性的关键“传动者”。本实验采用原代大鼠海马神经元氧化应激损伤模型，引入BDNF/TrkB通路抑制剂(K252a)，对照研究了神经复元方治疗PSD的部分分子机制。通过定量RT-PCR检测发现，H2O2组神经元突触相关蛋白SYNA、SYNI的基因表达相比正常对照组明显下降，经含有神经复元方的血清干预后，含药血清+ H2O2培养组的SYNA、SYNI的基因表达水平得到提升，基本与正常对照组相当，而加入BDNF-TrkB信号通路阻断剂K252a和含药血清的组，神经元突触蛋白SYNA、SYN I的表达水平并无明显提升。通过蛋白质印迹法定量检测BDNF/TrkB信号通路突触可塑性相关蛋白SYNA、SYNI和突触生长相关蛋白GAP-43的表达水平，结果基本与定量RT-PCR的一致，含药血清+ H2O2培养组SYNA、SYNI的蛋白表达水平显著高于H2O2培养组，基本上恢复到正常对照组水平。通过透射电镜观察发现含药血清+ H2O2培养组相比H2O2培养组神经元突触密度增大，突触后致密物厚度增厚。

综合以上情况，我们认为神经复元方能够修复海马神经元氧化应激损伤模型的突触可塑性，其作用发挥与BDNF/TrKB信号通路密切相关，可能是通过介导该信号通路调节突触蛋白基因，促进海马SYNI和SYNA的表达，从而达到修复神经功能的作用，但其作用机制有待进一步深入研究。