肿瘤抑制因子miR-99a对口腔鳞状细胞癌细胞迁移、增殖和凋亡的影响

梁源 张珊 (漯河医学高等专科学校，河南 漯河 46000；漯河医学高等专科学校第二附属医院)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)约占口腔癌病的90%〔1，2〕。尽管手术，化学疗法和放射疗法等治疗方法对病人的病情有所改善，但OSCC患者的总体预后仍然不能令人满意〔3〕。一些沉默的肿瘤抑制基因在OSCC的进展中起关键作用。因此，理解异常肿瘤抑制基因表达机制对于建立新的治疗策略，甚至是改善OSCC的预后至关重要〔4〕。研究证实，大多数基因组被转录为非编码RNA，包括microRNA(miR)〔5〕。miRNA是进化上保守的单链RNA，由21～24个核苷酸组成。miRNA可以通过靶向mRNA的3′-非翻译区(UTR)来触发信使RNA(mRNA)降解或翻译抑制〔6〕。研究表明，miR与各种癌症的发生发展和预后有关〔7〕。miR可能在OSCC中失调〔8〕。例如，与邻近的正常组织相比，miR-15a在肾细胞癌组织中显著下调〔9〕。报道，包括miR-21、miR-31、miR-155、miR-26b、miR-107和miR-99家族在内的几种miR在口腔癌中起致癌基因或肿瘤抑制基因的作用〔10〕。miR-99a是口腔癌细胞中下调最多的miR。miR-99a是miR-99家族的成员，由染色体21q处的C21orf34基因的内含子13编码。与实体瘤中染色体21q的频繁丢失一致。在几种癌症类型中检测到miR-99a表达的减少。包括前列腺癌，肝癌，膀胱癌和口腔癌等〔11〕。这些研究显示了miR-99a的表达可以通过靶向3′UTR降低了一些原癌基因的表达，表明miR-99a具有肿瘤抑制作用。本研究拟探讨miR-99a在OSCC中的表达和生物学功能。

1 材料和方法

1.1材料 人OSCC细胞系(SCC6，SCC9，SCC25和HN4)和正常人口腔角质形成细胞(HOK)由实验室常规保存。所有的细胞在RPMI1640或者DMEM培养基中培养。除此之外，细胞培养时补充5%胎牛血清，1%抗生素(100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2RNA提取和逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 为了定量OSCC细胞系中的miR-99a mRNA表达，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，在使用NanoDrop2000c测量RNA浓度后，并使用TaqMan MultiScribe Reverse Transcriptase合成互补DNA(cDNA)，进行qPCR。使用ABI Prism 7900-HT序列检测系统(96孔，Applied Biosystems)进行qRT-PCR分析。miR-99a的正向引物为5′-CTCGAGCATCCTTAGAACTCAGC-3′，反向引物为5′-CTGCCTTGTAAGACAGAC-3′。U6为内参，正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCt方法分析细胞中miR-99a的表达水平。循环条件如为95℃ 2 min，95℃ 10 s，55℃ 30 s和72℃ 30 s，40个循环。

1.3细胞转染 miR mimics可以增强内源miR的调节。转染miR-99a mimics可以让HN4和SCC6细胞miR-99a的表达上调，使用Lipofectamine2000转染，细胞培养使用Opti-MEM培养基。

1.4CCK-8测定细胞增殖 使用CCK-8测定法评估HN4和SCC6细胞的增殖能力。将细胞(5 000个/孔)接种在96孔板中，然后用miR-99a mimics，NC mimics转染。向每个孔中加入10 μl CCK-8溶液，37℃ 5%CO2的培养箱中避光孵育30 min。将细胞孵育0、24、48和72 h后，使用酶标仪测量450 nm处每个孔的OD值。

1.5细胞划痕实验 用于评估HN4和SCC6细胞的迁移能力。在6孔板中每孔中接种1×106个细胞。24 h后用miR-99a mimics，NC mimics转染细胞。转染后，将细胞在无血清和抗生素的培养基中于37℃培养24 h。接下来，通过拖动无菌的1 ml移液管末端造成细胞划痕。使用相机系统在0、12和24 h捕获划痕的图像。

1.6Transwell试验 通过Transwell测定检查HN4和SCC6细胞的侵袭能力。使用具有Matrigel的Transwell室评估侵袭能力。转染后24 h，用DMEM将2×104个细胞加入每个上室中，并向下室中加入补充有10%胎牛血清的DMEM。将细胞在5%CO2培养箱中于37℃孵育48 h。固定下室中的细胞，并在室温下依次用4%多聚甲醛和结晶紫染色20 min。最后，使用光学显微镜观察腔室底部的细胞。在4个随机选择的视野中对细胞进行计数。

1.7细胞凋亡和细胞周期分析 1×106个HN4和SCC6细胞分别接种在6孔板中，miR-99a mimics、NC mimics 转染细胞，转染后48 h，收获细胞，并使用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次。使用100 μl 1×结合缓冲液重悬细胞。加入5 μl膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯(FITC)和5 μl碘化丙锭(PI)，室温下避光染色15 min。最后，在每个管中加入400 μl 1×结合缓冲液后，使用流式细胞仪评估细胞凋亡情况。对于细胞周期分析，收获1×106个细胞，用70%乙醇固定过夜。然后加入Rnase A(100 μg/ml)、碘化丙锭(50 μg/ml)及含有0.1%Triton X-100的PBS，37℃下染色30 min。通过流式细胞术进行细胞周期分析，FlowJo6.1分析数据。

1.8统计学分析 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1miR-99a的表达水平在OSCC细胞系中下调 HN4、SCC6、SCC9、SCC25 miR-99a表达水平分别是(2.62±0.31)、(3.42±0.22)、(6.45±0.34)、(7.83±0.42)，OSCC细胞系中miR-99a的表达水平较人正常口腔角质形成细胞HOK(10.83±0.43)显著下降。推测miR-99a可能在OSCC中充当抑癌基因。转染后24 h后，与NC组(3.35±0.54)比较，miR-99a组miR-99a表达水平在HN4(99.12±4.13)和SCC6(102.13±6.43)细胞显著升高。

2.2miR-99a的上调抑制HN4和SCC6细胞的增殖 在转染后24、48和72 h，miR-99a mimics组HN4和SCC6细胞的增殖显著低于NC组(P<0.05)。见表1。

2.3miR-99a的上调抑制HN4和SCC6细胞的侵袭 与NC组(NH4：0.87±0.04、SCC6：0.78±0.06)相比，miR-99a mimics组HN4、SCC6细胞的侵袭能力显著下调(0.52±0.05、0.48±0.03，均P<0.05)。见图1。

细胞组别0 h24 h48 h72 hHN4NC组0.22±0.050.56±0.040.82±0.050.92±0.06miR-99a mimic组0.23±0.060.42±0.041)0.68±0.061)0.76±0.071)SCC6NC组0.24±0.040.67±0.060.89±0.061.07±0.08miR-99a mimic组0.23±0.030.42±0.061)0.72±0.081)0.82±0.061)

与NC组比较：1)P<0.05；表2同

图1 Transwell试验评估miR-99a对HN4和SCC6细胞的侵袭能力(结晶紫染色，×100)

2.4miR-99a的上调抑制HN4和SCC6细胞的迁移 与NC组〔NH4相对迁移距离(0.72±0.03)μm、SCC6(0.69±0.04)μm〕相比，miR-99a mimics组HN4、SCC6细胞的迁移能力显著下调〔(0.53±0.04)μm、(0.52±0.06)μm，均P<0.05〕，见图2。

2.5miR-99a的上调诱导HN4和SCC6细胞的凋亡 与NC组〔HN4凋亡率为(4.63±0.32)%、SCC6(2.28±0.38)%〕相比，miR-99a mimics组HN4、SCC6细胞的凋亡率显著升高〔(9.83±0.42)%、(9.18±0.64)%，均P<0.05〕。见图3。

2.6miR-99a的上调对HN4细胞周期的影响 miR-99a mimics组HN4细胞在G1 期的百分比明显高于NC组(P<0.05)，G2 期和S期的百分比明显低于NC组(P<0.05)。见图4,见表2。

图2 培养不同时间细胞划痕实验检测miR-99a对HN4和SCC6细胞的迁移能力(×10)

图3 流式细胞术检测miR-99a对HN4和SCC6细胞凋亡的影响

图4 流式细胞术检测miR-99a对HN4细胞周期的影响

表2 miR-99a对HN4细胞周期的影响

组别G0/G1期S期G2/MNC组50.41±3.3234.45±2.8115.14±3.57miR-99a mimic组79.95±1.621)10.15±1.831)9.91±2.521)

3 讨 论

研究显示，中国台湾地区口腔癌发病率惊人增加的原因，除了吸烟和喝酒之外还喜欢食用槟榔〔12〕。尽管癌症治疗和诊断取得了进展，但口腔癌的5年生存率在过去的2～3年中保持不变。口腔癌预后不良的主要原因是快速局部侵袭和扩散及高复发率。了解口腔癌发生和转移涉及的机制对克服这种恶性肿瘤非常重要〔13〕。miR在转录水平后负责调控基因表达，在肿瘤学中有广泛研究。由于单个miR可能靶向数百个mRNA，异常的miR表达可能会影响大量的转录本，而且会影响癌症相关的信号通路〔14〕。miR的表达在组织特异性中受到高度调控。此外，miR-mRNA相互作用的组合意味着相同的miR可以具有不同的靶标，并且相同的mRNA可以被不同细胞类型中的不同miR靶向。因此，相同的miR可以参与不同的途径，对细胞生存、生长和增殖具有不同的影响〔15〕。

miR是重要的转录后调节因子，它们参与各种生理和病理过程，包括细胞分化、细胞增殖和肿瘤发生发展过程。miR过度表达时被证明可作为致癌基因，miR下调时被用作肿瘤抑制基因。对于miR-99a有很多相关研究，在肺癌中，miR-99a下调导致哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)3的上调，并促进肿瘤生长和存活〔16〕。MiR-99a通过抑制mTOR和染色质重塑因子(SMARCA)5和SMARCD1抑制前列腺特异性抗原产生和前列腺细胞增殖〔17〕。下调miR-99a表达与肝细胞癌患者的不良预后有关，并且异常miR-99a表达通过靶向IGF1受体(IGF1R)和mTOR来抑制肝细胞生长〔11〕。miR-99a mimics的转染降低了头颈癌细胞中mTOR和IGF1R的表达。通过生物信息学预测和使用微阵列分析的实验验证，确定IGF1R和mTOR是miR-99a的直接靶标〔18〕。但也有研究证实自噬调节因子(MTMR)3是一种新型的miR-99a靶标〔19〕。可能miR-99a不仅仅只有一个靶标，哪一个靶标是最准确、有效且直接作用于信号通路的需要进一步研究。

肿瘤抑制miR通常在癌细胞中下调〔20～22〕。miR-99a是口腔癌细胞中下调最多的miR〔23〕。下调的miR-99a可以具有肿瘤抑制的功能，miR-99a表达减少口腔癌细胞的迁移和侵袭，抑制了口腔癌细胞的增殖，促进了口腔癌细胞的凋亡〔24〕。总之，miR-99a通过减少细胞迁移和侵袭就表现出具有抗肿瘤的作用〔25〕。miR-99a在临床口腔癌样本中是下调的，与本实验结果一致，所以认为miR-99a在口腔癌中的下调可以用作口腔癌的诊断标志物。