十二井穴刺络放血对脑缺血大鼠脑组织缺氧状态及能量代谢紊乱的影响

高靓 韩宝杰 李兰媛 徐梦瑶 孟雪

(1天津中医药大学第一附属医院针灸临床部 国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193；2天津中医药大学)

脑血管病是一种对人类健康有着严重危害的多发病与常见病，具有高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率等特点〔1〕。在全部脑血管病中缺血性脑血管病占主要比重，约为75%，且近年来有升高趋势，可见其防治的严峻性〔2〕。缺血性脑血管病在祖国传统医学中属“中风”范畴，脏腑经络气血阴阳失调是疾病发病的主要病因，脑髓病变为其本，脏腑病变为其标，经络则为委，是本虚标实之证〔3，4〕。因祖国传统医学有其独特之处，为进一步提高脑缺血治疗的效果，可考虑采取中医治疗。《内经》中首次提到将针刺用于“中风”的治疗，且该治疗方法被后来的历代医家完善与发展，积累了大量的理论与临床经验，其带来的治理效果理想，治疗机理独特〔5〕。但现有的研究多涉及针刺在脑卒中恢复期的应用，将其直接用于脑卒中急性起病后的治疗是否可行尚未见较多报道。目前国内外研究越来越重视脑缺血早期的治疗，这对逆转患者脑神经功能缺损、改善其预后意义重大。刺络放血即祖国传统医学中的刺血疗法，十二井穴刺络放血能够起到极佳的活血化瘀、活络通经、开窍启闭、祛除邪气、促正气恢复之效，故认为将其用于脑卒中的治疗有重要价值〔6，7〕。但与之相关的研究并不多见。本研究建立脑缺血大鼠模型，给予其十二井穴刺络放血治疗，主要观察十二井穴刺络放血对大鼠脑组织缺氧状态及能量代谢紊乱的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 成年健康SD雄性大鼠共50只，体重0.25～0.27 kg，平均(0.25±0.01)kg，月龄为2～3个月，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，编号：SCXK(京)2016-0006，饲养于实验室动物房笼具内(绍丰SIM型、SIR型独立换气系统笼具)，温度：(22±2)℃，湿度≥40%，动物饲养及手术、给药和取材等各个环节均符合国际动物伦理相关动物福利要求，伦理号(TCM-LAEC2018027)，自由饮食水。术前12 h禁食。

1.2实验试剂 上海太阳生物有限公司提供的组织型纤溶酶原激活物(tPA)试剂盒(批号：170520)、南京建成生物工程研究所提供的一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(批号：170524)、上海太阳生物有限公司提供的肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(批号：170511)、尼地平注射液由山东新华制药厂提供(批号170321)、甲醛由开封化学制品提供(批号：170514)、胆固醇购自天津化学制品厂(批号：170510)。

1.3主要仪器及设备 上海第三仪器提供分光光度仪、四川智诚医疗仪器公司提供酶标仪、南京建成生物科技提供的玻璃匀浆器、日本SHIMAPZN提供的精密天平、北京长安科学仪器提供的恒温水浴箱、上海医用分析仪器厂提供的离心机、日本OLYMPUS提供的生物显微镜。其他材料还包括：一次性注射器、毫针、量杯、量筒、漏斗、烧杯、止血钳、镊子、手术剪、吸管、试管、离心管、盖玻片、载玻片等。

1.4动物模型建立与分组 大鼠均接受纹状体微透析导管埋植，并在术后随机选择10只大鼠作为空白组。除空白组大鼠之外，其他40只大鼠均制备急性脑缺血模型，方法参照文献中线栓法〔8〕，并进行部分改良，并将建模成功的大鼠纳入实验，随机分为3组，包括模型组、吸氧组与十二井穴刺络组。为避免实验期间大鼠感染或死亡，术后将大鼠置于无垫料鼠盒内，待苏醒后在放入有垫料的鼠盒，大鼠能够自行进食与饮水，每日使用碘酒对手术局部消毒。

1.5干预方法 空白组与模型组大鼠不进行其他干预。吸氧组给予50%浓度氧气吸入60 min，十二井穴刺络组给予十二井穴刺络放血：(1)穴位定位：参照《实验针灸学》〔9〕，模拟家兔十二井穴取穴方法：第一指桡，爪根角旁侧0.1 cm处即“少商”；第二指桡，爪根角旁侧0.1 cm处即“商阳”；第五指尺，爪根角旁侧0.1 cm处即“少泽”；第五指桡，爪根角旁侧0.1 cm处即“少冲”；第三指掌侧顶端中位，爪根0.1 cm处即“中冲”；第四指尺侧，爪根角旁侧0.1 cm处即“关冲”；第二趾腓，爪根角旁侧0.1 cm即“厉兑”；第一趾胫，爪根角旁侧0.1 cm处即“隐白”；第五趾腓，爪根角旁侧0.1 cm处即“至阴”等，其余还包括涌泉、足窍阴与大敦。(2)刺络方法：佩戴无菌手套，一人抓大鼠背部皮肤，头部固定，一手固定尾部；另一人点刺各个穴位，针刺前应严格消毒，以毫针点刺后出血3～5滴为宜。每日上午定时治疗，1次/d，左右两侧交替刺络。治疗时间为3 d。

1.6指标检测

1.6.1脑组织缺氧状态 对大鼠进行断头处理，处死后将头部皮肤切开，使用咬骨钳较颅骨掀开，脑组织充分暴露，无菌条件下将大脑组织分为左半球与右半球，将右侧脑组织取下后去除小脑，称重后向内放入适量的10%甲醛溶液固定备用。根据重量体积比为1∶9的比例加入生理盐水，使用匀浆器制备脑组织匀浆，后以3 000 r/min转速离心15 min，取上清液检测脑组织缺氧状态相关指标，包括NOS、TNF-α、tPA。严格按照试剂盒步骤操作，使用酶联免疫吸附试验测定tPA含量；在一氧化氮作用下，氧合血红蛋白氧化为甲基血红蛋白，活性提示每分钟每毫克脑组织可以生成1个NOS活力单位(U/ml)；采用液相竞争法测定TNF-α含量。整个实验期间动物的处理均严格符合国家科技部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》〔10〕。

1.6.2能量代谢紊乱 脑组织的采集与处理同1.3.1，收集样本后使用分析仪与对应的试剂盒测定样本内γ-氨基酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量，检测方法均为高效液相法。

1.7统计学方法 应用SPSS20.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1建模结果 40只用于模型建立的大鼠，最终成功建模33只，其他7只大鼠建模失败并合理处理，将建模成功的33只大鼠随机分为了模型组、吸氧组与十二井穴刺络组，各11只。

2.2各组脑组织缺氧状态相关指标比较 空白组脑组织中NOS、TNF-α水平表达最低，tPA水平最高，后依次为十二井穴刺络组、吸氧组、模型组，除空白组与十二井穴刺络组NOS指标无显著差异外，其余组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别nNOS(U/ml)TNF-α(pg/ml)tPA(ng/ml)空白组1030.01±1.421.57±0.0616.78±0.29模型组1134.98±1.491)2.24±0.041)10.32±0.491)吸氧组1133.64±1.611)2)2.10±0.031)2)11.71±0.411)2)十二井穴刺络组1132.02±1.512)3)1.88±0.081)2)3)13.00±0.791)2)3)F值21.064276.582280.880P值<0.001<0.001<0.001

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与吸氧组比较：3)P<0.05；表2同

2.3各组能量代谢紊乱相关指标比较 空白组GABA、Glu含量最低，后依次为十二井穴刺络组、吸氧组、模型组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组能量代谢紊乱相关指标水平比较

3 讨 论

缺血性脑血管疾病的发病率是出血性脑血管疾病的3倍左右，具有高发病率、高致残率、高复发率、高死亡率等特点〔11〕。故疾病的早期检出与治疗极为关键。

脑缺血以猝然晕倒、不省人事，伴语言不利、口鼻歪斜、半身不遂等为主要症状，起病急，病情变化迅速，与自然界中风性善变特性相近，故古代医家将这类疾病以“中风”命名，又因疾病发病突然，故称之为“卒中”，但该病与《伤寒论》中提及“中风”实质各异〔12，13〕。关于脑卒中的病因病机，历代医家均有论述，在病因方面经历了外因到内因论的变化，随着近现代对脑卒中的不断了解与研究，认为“气血不足、脑空”是脑卒中主要病机〔14〕。脑缺血发生时缺血导致的灌注损伤是引起神经元发生不可逆损伤并致残的关键，故如何选穴，并给予患者合理的针刺治疗，能够减少缺血再灌注损伤带来的影响一直是临床研究的重点〔15〕。

本研究中采用的刺络是一种刺血疗法，凡属大热、气结、痰凝、血瘀等病症均可使用该方法治疗，由针灸理论来看，刺络的实施能够通过调和气血、祛瘀通络、祛邪解表、泄热解毒、急救开窍等途径来调整机体经络、脏腑、气血等功能，故而可考虑将其用于脑卒中的治疗〔16〕。然而刺络放血疗法的实际应用价值并未得到较多循证学证据支持，且在选穴方面也有一定争议。祖国传统医学认为脑卒中的病机为气、血、风、火、虚、痰六端，肝肾亏虚是其根本，这些病机在一定条件下可以相互影响并相互作用导致疾病突然发作〔17〕。故可以根据上述病机为脑卒中的刺络放血治疗选穴。十二井穴是一类由阴引阳的穴位，包括至阴、中充、涌泉、关冲、大敦、少商、商阳、少冲、隐白、少泽等，十二井穴刺络放血能够大接经气，促十二经之气通调〔18〕。而脑缺血正是因经气不通、血气不畅，左右无法环周导致发病，故十二井穴刺络放血能够使经气相通，促左右环周，不失为一种脑缺血有效的治疗方法。脑缺血患者在发病后多存在脑组织缺氧，而脑组织缺氧又会导致能力代谢发生紊乱，故观察十二井穴刺络放血对脑缺血患者脑组织缺氧及能量代谢紊乱是否有良好影响，便可确定该方法的脑缺血中的应用价值。本研究成功建立了脑缺血大鼠模型，并对其进行分组与治疗，结果显示，在治疗3 d后，十二井穴刺络组大鼠脑组织缺氧状态改善情况最理想，且患者能量代谢紊乱情况较其他组得到很好的纠正。结果显示，十二井穴刺络放血用于脑缺血大鼠的治疗用重要的价值，还应在未来多开展类似的临床实验研究来证实其治疗有效性安全性，以指导临床制定更为安全有效的脑缺血治疗方案，减少患者因脑组织缺血缺氧导致的一系列损伤。

综上所述，十二井穴刺络放血能够减轻脑缺血大鼠一氧化氮神经毒性，改善大脑缺氧状态，纠正大脑能量代谢紊乱的情况，调节大鼠脑组织微循环，保护脑神经细胞，对阻止脑缺血大鼠脑损伤进一步发展有着积极意义。