腰果寡肽的制备及体外抗过敏效应

陈 笛 姜 珂 周 鑫 曹献英 -

(海南大学食品科学与工程学院，海南 海口 570228)

IgE介导变态反应又称过敏反应，是由包括某些食物、灰尘、螨虫和花粉等许多过敏原引发的炎症反应。这些过敏原与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的IgE抗体特异性结合，从而激活肥大细胞或嗜碱性粒细胞，使其释放具有生物学活性的介质，如颗粒相关介质、细胞因子和炎性脂质，导致过敏性炎症反应[1-2]。IgE介导变态反应包括湿疹、过敏性鼻炎或特应性皮炎等，严重情况下会造成虚脱和休克，甚至危及生命[3]。目前常采用的治疗方法是药物控制，抗过敏药物虽然起效快，但副作用大，容易产生耐药性。开发具有抗过敏效应的保健食品，弥补传统药物疗法不足显得尤其重要[4]。抗过敏保健食品主要来源植物提取物，其有效成分包括黄铜类、萜类、醌类和生物碱等，近几年，许多研究[5-6]还报道益生菌、海藻多糖和食源性寡肽等也具有抗过敏效应。

作为一种热带特色食物，腰果因其富含脂质(45%～50%)和蛋白质(21%)的高营养品质而被重视。目前关于腰果的研究主要集中在腰果酚和腰果油[7]，对腰果蛋白研究主要停留在研究其结构特性，未见有探究腰果寡肽的功能作用的报道。腰果蛋白是具有高营养价值的优质蛋白质，是获得功能性肽的潜在资源[8]。纯化鉴定腰果寡肽不仅可以为深度开发腰果资源提供理论数据，还可以延长腰果深加工产业链。试验拟以腰果蛋白为原料，通过酶解法制备腰果粗寡肽，采用葡聚糖凝胶柱和C18柱连续分离纯化获得腰果寡肽，探讨其抗过敏效应，以期为开发具有抗过敏效应的保健食品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腰果蛋白：实验室自制；

P815小鼠肥大细胞瘤细胞：中国典型培养物保藏中心；

透明质酸酶和透明质酸钠：上海阿拉丁生化有限公司；

anti-DNP-IgE：美国Sigma公司；

DNP-BSA：美国Biosearch公司；

4-硝基苯-N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷：上海源叶生物科技有限公司；

组胺试剂盒：长沙达尔锋生物科技有限公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

半制备型液相：LC-20AP型，日本岛津公司；

高效液相色谱仪：1260型，配全波长紫外检测器，美国安捷伦科技公司；

流式细胞仪：CytoFLEX型，美国贝克曼库尔特生物科技有限公司；

二氧化碳培养箱：MCD-175型，日本三洋公司；

倒置显微镜：CKX31型，日本奥林巴斯有限公司；

超净工作台：SW-CJ-1FD型，苏净安泰设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的筛选 根据杨雪等[9]的酶解法制备腰果粗寡肽。分别用碱性蛋白酶(丝氨酸蛋白酶、pH 10.0，60 ℃)、中性蛋白酶(沙雷肽酶、pH 7.0，50 ℃)、木瓜蛋白酶(pH 7.0，50 ℃)、菠萝蛋白酶(pH 8.0，55 ℃)和复合蛋白酶(pH 7.0，50 ℃)酶解腰果蛋白。水解度(DH)采用甲醛滴定法[10]检测，多肽得率(TCA-YSP)根据潘进权等[11]的方法测定。

1.3.2 腰果寡肽的分离纯化 用截留分子量为10 kDa和3 kDa超滤离心管在4 ℃条件下离心，分别收集滤过和未滤过溶液，得到3种不同分子量范围的腰果粗寡肽。样品经Sephadex-G15和Sephadex-G50纯化，凝胶填料的玻璃层析柱(1.6 cm×50 cm)，样品用超纯水配制为100 mg/mL，取1 mL加入已平衡的层析柱，检测波长为220 nm。半制备色谱条件：

① 上样条件：样品用含0.1%三氟乙酸的超纯水配制为100 mg/mL，取1 mL加入色谱柱；

② 色谱柱：ODS HYPERSIL制备柱(Φ250 mm×10 mm，5 μm)；

③ 紫外检测器：检测波长220 nm；

④ 流动相：A为含0.05% TFA的乙腈，B为含0.05% TFA的超纯水；

⑤ 梯度洗脱：0～15 min，0%～30%的流动相A、15～25 min，30%～35%的流动相A、25～40 min，35%～40%的流动相A。

1.3.3 腰果寡肽纯度和结构鉴定 采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定纯度。RP-HPLC的样品用含0.1% 三氟乙酸的超纯水溶解，上样浓度为100 mg/mL，0.45 μm滤膜过滤。色谱柱为Symmetyr C18色谱柱(Φ250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温25 ℃，其他色谱条件同1.3.2。

利用傅里叶变换红外光谱仪对样品定性分析，样品在500～4 000 cm-1范围内进行红外光谱扫描。质谱分析使用SCIEX公司的TripleTOF 5600液质联用系统进行。肽段样品通过自动进样器吸入后结合至C18捕获柱(5 μm，5 mm×0.3 mm)，接着被洗脱至分析柱(75 μm×150 mm，3 μm 径，10 nm孔径)进行分离。利用两个流动相(流动相A：水+0.1%甲酸；流动相B：乙腈+0.1%甲酸)建立30 min的分析梯度(0 min 5% B；15 min 5%～35% B；1 min 35%～80% B；5 min 80% B；0.1 min 80%～5% B；8.9 min 5% B)。液相的流速设置为300 nL/min。质谱IDA模式分析时，每个扫描循环中包含一个MS全扫描(m/z范围是350～1 500，离子累积时间250 ms)，以及随后跟着的40个MS/MS扫描(m/z范围是100～1 500，离子累积时间50 ms)。MS/MS采集的条件设置为母离子信号>120 cps，电荷数为+2～+5。离子重复采集的排除时间设置为18 s。

1.3.4 透明质酸酶抑制率测定 采用Elson-Morgan 改良法[12]。

1.3.5 细胞脱颗粒测定

(1) 敏化细胞：调整P815细胞密度为2×105个/mL，取48孔板，每孔加190 μL细胞悬液和10 μL终浓度为0.5 μg/mL anti-DNP-IgE，培养箱(37 ℃，5% CO2)孵育过夜[13]。

(2) 刺激细胞：次日弃培养液，用PBS洗涤敏化后的细胞3遍，空白对照组和模型组每孔加190 μL Tyrode’s缓冲液，试验组每孔加190 μL溶于Tyrode’s缓冲液的样品溶液，样品终浓度为50，200，500 μg/mL，继续培养1 h。样品孵育1 h后，空白对照组加10 μL Tyrode’s缓冲液，模型组和试验组加10 μL终浓度为0.5 μg/mL DNP-BSA刺激敏化细胞1 h，收集细胞上清液于1.5 mL EP管中。

(3) 检测β-氨基己糖甘酶(β-HEX)释放率：参照Bansod等[14]的方法，按式(1)计算β-HEX释放率。

(1)

式中：

c——β-HEX释放率，%；

m1——上清液中β-HEX的OD值；

m2——细胞裂解液中β-HEX的OD值。

(4) 检测上清液中组胺释放量：按1.3.5(1)和1.3.5(2)的方法处理细胞，收集上清液，根据组胺试剂盒说明书，检测上清液中组胺的含量。

(5) 磷脂酰丝氨酸外翻测定：收集2×105个细胞，用500 μL结合液重悬，加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，采用流式细胞仪检测。

1.4 统计学分析

利用SPSS 22.0统计分析软件，采用单因素方差分析，比较结果间的差异性(P<0.05差异显著；P<0.01差异极显著)，采用Graphpad Prism7.0完成绘图。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶的酶解能力比较

如表1所示，碱性蛋白酶酶解液的DH和TCA-YSP明显高于其他蛋白酶，分别为(17.06±1.52)%，(26.28±0.13)%，说明碱性蛋白酶是5种蛋白酶中分解效率较高的蛋白酶，此结果与He等[15]的研究结果一致。DH和TCA-YSP与酶切位点和底物溶解性有关，蛋白酶的酶切位点越广泛和底物溶解度越高可获得更高DH和TCA-YSP[16]。碱性蛋白酶具有众多的酶切位点且腰果蛋白在其最适pH范围内溶解度最高，因此，后续研究均选择碱性蛋白酶为水解酶。

表1 不同酶制备的酶解液水解度(DH)和多肽得率 (TCA-YSP)†

Table 1 Degree of hydrolysis (DH) and TCA-soluble peptide yield (TCA-YSP) of hydrolysates prepared by different enzyme (n =6) %

蛋白酶DHTCA-YSP碱性蛋白酶26.28±0.14a17.06±1.5a复合蛋白酶21.76±0.47c7.16±0.71c中性蛋白酶23.47±0.47b5.29±0.56d木瓜蛋白酶13.18±0.34c2.96±0.27e菠萝蛋白酶21.94±0.61d9.39±0.65b

† 同列小写字母不同表示不同蛋白酶的DH和TCA-YSP之间具有显著性差异(P<0.05)。

2.2 腰果寡肽的分离纯化

由图1可知，分子量<3 kDa组分的透明质酸酶抑制率显著高于分子量>10 kDa和3～10 kDa的组分(P<0.05)，说明具有抗过敏效应的成分主要集中在分子量<3 kDa的组分中。F1-a组分的透明质酸酶抑制率为(93.93±0.38)%，显著(P<0.05)高于F1-b组分，说明F1组分中主要是F1-a起作用。

字母不同表示不同组分之间具有显著性差异(P<0.05)图1 各组分的透明质酸酶抑制率Figure 1 Hyaluronidase inhibition rate of each component

图2表示分子量<3 kDa的组分经Sephadex-G15层析柱脱盐处理得F1组分，F1组分经Sephadex-G50层析柱得到两个组分F1-a和F1-b(如图3所示)。

从F1-a的柱层析分离谱图的峰形和峰强来看，F1-a组分在分子量<3 kDa组分中含量较高，且纯度高于F1-b组分。因此，后续将F1-a组分应用到半制备液相。

图2 腰果粗寡肽经Sephadex G-15凝胶柱层析分离谱图

Figure 2 Chromatography spectrum of cashew nut crude oligopeptides separated on sephadex G-15 gel column

图3 腰果粗寡肽经Sephadex G-50凝胶柱层析分离谱图

Figure 3 Separex G-50 gel column chromatography spectrum of cashew nut crude oligopeptides

F1-a组分经制备型C18柱分离后得到一个组分F1-a-1(如图4所示)。F1-a-1峰强较高，说明其在F1-a组分含量占比高，且F1-a-1组分对透明质酸酶抑制率为(95.53±2.75)%，因此，将F1-a-1组分用于进一步探究其抗过敏效应及机制。

2.3 腰果寡肽的纯度和结构特性

图5、6分别为F1-a-1组分的RP-HPLC图谱和傅里叶红外光谱图。

图4 F1-a组分经半制备型液相分离谱图Figure 4 Spectrum of F1-a components separated by semi-preparative liquid phase

图5 F1-a-1组分的RP-HPLC图谱Figure 5 RP-HPLC spectrum of the F1-a-1 component

图6 F1-a-1组分的红外光谱图Figure 6 Infrared spectrum of the F1-a-1 component

由图5可知，F1-a-1组分杂峰较少，说明F1-a-1组分纯度较高。图6表明，F1-a-1组分在1 654.5～1 403.1 cm-1处的吸收峰为酰胺键的特征吸收，这是蛋白质的典型特征[17]。3 422.4 cm-1处可能是N—H和O—H的吸收，2 926.6 cm-1处的吸收峰可能是—CH3的伸缩振动，1 099.4 cm-1和600.6 cm-1的吸收可能是—NH2的伸缩振动[18]。酰胺I带(1 700～1 600 cm-1)是蛋白质骨架的最突出和最敏感的振动带，与蛋白质的二级结构有关。波数在1 660～1 695 cm-1范围为β-转角，1 650～1 658 cm-1范围为α-螺旋，1 640～1 650 cm-1范围为无规则卷曲，1 610～1 640 cm-1范围为β-折叠[19]。图6中F1-a-1组分在1 654.5 cm-1有伸缩振动，说明该组分中含有α-螺旋。

F1-a-1组分经质谱鉴定为氨基酸序列Ile-Ile-Ala-Ile-Pro-Ala-GIy-Val-Ala-His(IIAIPAGVAH)的腰果寡肽(图7)。

图7 F1-a-1组分的二级质谱图Figure 7 Tandem mass spectrum of the F1-a-1 component

腰果寡肽含有多个异亮氨酸，表明其具有α-螺旋结构倾向[20]，与其红外图谱结果一致。该寡肽中不含芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、亮氨酸、赖氨酸和精氨酸等胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶切位点，且寡肽中的脯氨酸残基可能会在肽链上赋予独特的构象约束，可防止其在胃肠消化中被分解，保留活性[21]。在腰果寡肽纯化过程中，从1 000 g脱脂腰果粉可制备29.17 g腰果酶解产物，经纯化后可获得0.10 g腰果寡肽，由此可知，腰果寡肽得率为0.01%。在BIOPEP、PDB(the protein databank)和Uniprot数据库中搜索了该序列，但未找到相应的寡肽，提示试验中获得的腰果寡肽之前未被发现。

腰果寡肽的分子量为960.5 Da，分子量低的肽段可改善其在肠道中吸收并使其加速通过肠道屏障，产生生理效应[22]。另外研究[23]表明，只有多肽的分子量≥3.5 kDa才能与肥大细胞上IgE抗体交联引起过敏反应，分子量小的寡肽与IgE的交联能力低，甚至可以竞争性占据过敏原的结合位点，产生抗过敏效应。根据上述结果，将腰果寡肽用于后续试验。

2.4 腰果寡肽的抗过敏效应

2.4.1 对P815细胞脱颗粒的影响 由图8(a)可知，空白对照组P815细胞上清液中组胺浓度为(0.20±0.01) ng/mL；DNP-BSA刺激后上清液中组胺浓度为(0.89±0.05) ng/mL，显著高于空白对照组(P<0.01)；200，500 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同孵育后，上清液中组胺浓度分别为(0.55±0.02)，(0.51±0.07) ng/mL，显著低于仅用DNP-BSA刺激后上清液中的组胺浓度。组胺是由组氨酸脱氢酶脱羧形成，储存在正常肥大细胞中的分泌颗粒中，主要通过特异性组胺受体发挥其生物学效应，当肥大细胞受过敏原刺激后，随着脱颗粒分泌到胞外，引发过敏反应[24]。组胺仅存在于嗜碱性粒细胞和肥大细胞中，可将组胺释放量作为衡量肥大细胞脱颗粒强弱的重要标志物[25]。组胺虽为脱颗粒反应最典型的标志物，但它是一种极不稳定物质，半衰期短，要求迅速采集样品并且快速检测，因此，还需要结合其他指标做综合判断。

如图8(b)所示，DNP-BSA刺激后，P815细胞β-氨基己糖苷酶释放率为(45.23±3.42)%，显著高于空白对照组的[(7.73±0.96)%]，而200，500 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同孵育后，β-氨基己糖苷酶释放率显著降低(P<0.01)。综上所述，腰果寡肽显著抑制P815细胞中组胺和β-氨基己糖苷酶分泌，且浓度为200 μg/mL达到显著抑制。

β-氨基己糖苷酶是一种类胰蛋白酶，储存在肥大细胞分泌颗粒中[24]。正常情况下人体血液中几乎不含有β-氨基己糖激酶，当肥大细胞接触过敏原后，β-氨基己糖苷酶释放程度增加，其释放量与细胞脱颗粒程度存在量效关系。目前常用此指标作为肥大细胞活化脱颗粒的标志[26]。

A. 正常细胞 B. DNP-BSA诱导的细胞 C. 50 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于细胞 D. 200 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于细胞 E. 500 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于细胞 ##. P<0.01与空白组相比 **. P<0.01与模型组相比

图8 腰果寡肽对IgE-抗原复合物刺激的P815细胞组胺释放量和β-氨基己糖苷酶胺释放率的影响

Figure 8 Effect of cashew nut oligopeptide on histamine andβ-aminohexosidase amine release of P815 cells stimulated by IgE-antigen complex (n=6)

A. 正常细胞 B. DNP-BSA诱导的细胞 C. 50 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于细胞 D. 200 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于细胞 E. 500 μg/mL腰果寡肽和DNP-BSA共同作用于细胞 ##. P<0.01与空白组相比 **. P<0.01与模型组相比

图9 F1-a-1组分对IgE-抗原复合物刺激的P815细胞磷脂酰丝氨酸外翻的影响

Figure 9 Effect of F1-a-1 components on phosphatidylserine eversion of P815 cells stimulated by IgE-antigen complex (n=6)

2.4.2 腰果寡肽对磷脂酰丝氨酸外翻的影响 通过图9(a)画出P1门，即具有完整形态细胞的区域。基于P1门，得到P2门，即含有荧光探针细胞的区域，如图9(b)所示。各组P2门的平均荧光强度如图9(c)所示，与模型组相比，200 μg/mL和500 μg/mL腰果寡肽孵育后的细胞平均荧光强度显著降低(P<0.01)，说明腰果寡肽可抑制P815细胞脱颗粒，具有抗过敏效应。

肥大细胞脱颗粒的过程是通过胞吐作用将颗粒内的活性物质释放到胞外，荧光标记的Annexin V抗体可特异性地与脱颗粒过程中细胞膜上外翻的磷脂酰丝氨酸结合，可用流式细胞仪测定，平均荧光强度越强，磷脂酰丝氨酸外翻程度越强，即细胞脱颗粒程度越强。有研究[27]显示，Annexin V可以和细胞表面分泌颗粒发生特异性结合，结合程度与β-氨基己糖苷酶释放呈正比。

3 结论

研究以腰果蛋白为原料，依据不同蛋白酶的DH和TCA-YSP，确定碱性蛋白酶为制备腰果粗寡肽的最佳用酶；利用超滤、分子筛及半制备液相，从腰果粗寡肽中分离出含有α-螺旋且氨基酸序列为Ile-Ile-Ala-Ile-Pro-Ala-GIy-Val-Ala-His(IIAIPAGVAH)的腰果寡肽。通过测定腰果寡肽对肥大细胞中组胺和β-氨基己糖苷酶释放及磷脂酰丝氨酸外翻的影响，证明其有抗过敏效应。后续研究需进一步探究腰果寡肽在分子水平上的抗过敏机制。