自身免疫性肝病患者外周血miR-21、miR-155表达及其与Th17、Treg细胞平衡的关系

扎西吉，咸育婷

青海省第四人民医院检验科，青海 西宁 810000

自身免疫性肝病是一种因自身免疫功能失调发生的慢性肝病，主要包括自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎，其中自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化较为常见。自身免疫性肝病在女性中发病率高于男性，且由于遗传,环境中物理、化学等因素影响，近年来自身免疫性肝病发病率有逐年上升趋势[1]。探究自身免疫性肝病进展中相关影响因子，有助于病情及时评估和患者预后改善。辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)与调节性T细胞(T regulatory cells, Treg)的相互作用在维持机体免疫环境稳定中有重要意义。有研究报道，Th17/Treg平衡与肝脏疾病[2]及自身免疫性疾病[3]发生、发展有关。Thorlaciusussing等[4]研究发现，miR-21在溃疡性结肠炎组织中表达水平较对照组高，可作为溃疡性结肠炎生物标志物，用于疾病诊断。Singh等[5]研究表明，类风湿性关节炎中miR-155高表达，与患者临床病理特征有关，是类风湿性关节炎潜在标志物。由于miR-21、miR-155在免疫性肝病中表达水平及与Th17/Treg水平关系鲜有研究，本研究通过检测自身免疫性肝病患者外周血miR-21、miR-155表达水平，分析二者与Th17/Treg水平相关性，探究二者在自身免疫性肝病中意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年6月至2019年6月本院收治的自身免疫性肝病患者122例作为研究对象，男38例，女84例，年龄(48.63±14.21)岁(25～76岁)。根据自身免疫性肝炎[6]和原发性胆汁性肝硬化[7]诊断标准，将入组患者分为：自身免疫性肝炎59例，原发性胆汁性肝硬化63组。纳入与排除标准：纳入标准：(1)经诊断标准确诊为自身免疫性肝病;(2)临床资料完整;(3)患者及家属均表示知情，并签署知情同意书。排除标准：(1)心、肾功能严重不足者;(2)患有严重精神疾病者;(3)患有其他部位疾病者。另选取同期在本院健康体检者61名作为健康对照组，男19名，女42名，年龄(49.57±16.03)岁(24～73岁)。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 主要仪器和试剂qRT-PCR仪(型号：ABI 7500，美国ABI公司)、流式细胞仪(型号：FACSCalibur，美国BD公司)、总RNA提取试剂盒(货号：R1200-100，北京索莱宝科技有限公司)、反转录试剂盒(货号：RP1105，北京索莱宝科技有限公司)、实时荧光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)试剂盒(货号：RR820A，大连宝生物公司)、酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(货号：kl-001，上海康朗生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：所有入组者于清晨(7：00～9：00)空腹状态下采集外周静脉血5 ml，一部分离心20 min(4 ℃、3 000 r/min)后收集血清进行ELISA实验，另一部分用于qRT-PCR及流式细胞术实验。

1.3.2 qRT-PCR法检测外周血miR-21及miR-155水平：采用RNA提取试剂盒提取总RNA后，反转录获得cDNA模板，用于qRT-PCR实验。20 μl反应体系如下：SYBR® Mix Taq Ⅱ 10 μl，ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，上游引物0.8 μl，下游引物0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。具体反应步骤如下：95 ℃、33 s，1个循环；95 ℃、5 s；62 ℃、35 s，40个循环。每个样本重复3次，用2-△△CT法计算miR-21、miR-155表达水平，所用引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物Tab 1 qRT-PCR primer

1.3.3 流式细胞术检测外周血Th17及Treg细胞水平：采用Ficoll分离液分离并获取外周血单个核细胞(PBMC)，调整细胞数为2×106个/ml。分别加入100 ng/ml佛波酯、1 μg/ml离子霉素混匀，在CO2细胞培养箱中培养1 h，后加入1 μl/ml莫能霉素继续培养5 h。将细胞分为2份，分别加入相应单抗，用流式细胞仪检测Th17、Treg细胞水平及Th17细胞平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)，用winMDI 2.9进行数据分析。Th17水平用CD4+IL-17+在CD4+T细胞中百分比表示，Treg细胞水平用CD4+CD25+Foxp3+细胞在CD4+T细胞中百分比表示。

1.3.4 ELISA法检测血清细胞因子水平：采用ELISA法检测入组者血清白介素17(interleukin 17, IL-17)、IL-10、IL-23、IL-6、转化生长因子(transforming growth factor-β, TGF-β)水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 各组外周血miR-21、miR-155表达水平比较如表2所示，自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者外周血miR-21、miR-155表达水平均显著高于健康对照组(P均<0.05)。

表2 各组外周血miR-21、miR-155表达水平比较 Tab 2 Comparison of expressions of miR-21 and miR-155 in peripheral blood of each group

注：与健康对照组相比，*P<0.05。

2.2 各组Th17、Treg细胞水平比较自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者外周血Th17细胞比例、Treg细胞比例、Th17/Treg比值及Th17 MFI值均明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P均<0.05)(见表3和图1、图2)。

组别例数Th17细胞/% Treg细胞/% Th17/TregTh17 MFI自身免疫性肝炎组590.83±0.29*5.46±2.75*0.16±0.03*357.62±105.49*原发性胆汁性肝硬化组630.79±0.24*5.31±2.27*0.15±0.02*319.17±104.61*健康对照组610.46±0.133.54±1.150.13±0.03167.58±53.24

注：与健康对照组相比，*P<0.05。

图1 Th17流式细胞检测图(Q2区为Th17细胞所在区域)；图2 Treg流式细胞检测图(Q2区为Treg细胞所在区域) Fig 1 Th17 flow cytometry (Q2 was the region where Th17 cells were located); Fig 2 Treg flow cytometry (Q2 was the area where Treg cells were located)

2.3 各组血清中Th17、Treg细胞相关细胞因子水平比较如表4所示，自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者血清IL-10、IL-17、IL-23及IL-6水平均显著高于健康对照组(P均<0.05)，TGF-β水平均显著低于健康对照组(P均<0.05)。

注：与健康对照组相比，*P<0.05。

2.4 自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者外周血miR-21、miR-155表达水平与Th17/Treg相关性自身免疫性肝炎组患者血清miR-21表达水平与外周血Th17/Treg水平呈正相关(r=0.421，P=0.001)，miR-155表达水平与外周血Th17/Treg水平呈正相关(r=0.453，P=0.000)。原发性胆汁性肝硬化组患者血清miR-21表达水平与外周血Th17/Treg水平呈正相关(r=0.554，P=0.000)，miR-155表达水平与外周血Th17/Treg水平呈正相关(r=0.473，P=0.000)(见图3～图6)。

2.5 自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者外周血miR-21、miR-155表达水平与细胞因子相关性如表5所示，自身免疫性肝炎组患者外周血miR-21表达水平与IL-10、IL-17、IL-23呈正相关，与TGF-β呈负相关(P均<0.05)；miR-155表达水平与IL-10、IL-17、IL-6呈正相关，与TGF-β呈负相关(P均<0.05)。原发性胆汁性肝硬化组患者外周血miR-21表达水平与IL-10、IL-17、IL-6呈正相关，与TGF-β呈负相关(P均<0.05)；miR-155表达水平与IL-17、IL-23呈正相关，与TGF-β呈负相关(P均<0.05)。

图3 自身免疫性肝炎组患者血清miR-21与Th17/Treg水平相关性；图4 自身免疫性肝炎组患者血清miR-155与Th17/Treg水平相关性；图5 原发性胆汁性肝硬化组患者血清miR-21与Th17/Treg水平相关性；图6 原发性胆汁性肝硬化组患者血清miR-155与Th17/Treg水平相关性

Fig 3 Correlation between serum miR-21 and Th17/Treg in patients with autoimmune hepatitis; Fig 4 Correlation between serum miR-155 and Th17/Treg in patients with autoimmune hepatitis; Fig 5 Correlation between serum miR-21 and Th17/Tregin patients with primary biliary cirrhosis; Fig 6 Correlation between serum miR-155 and Th17/Treg in patients with primarybiliary cirrhosis

表5 自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者外周血miR-21、miR-155表达与细胞因子相关性分析Tab 5 The correlation of the expressions of miR-21, miR-155 with cytokines in peripheral blood of patients with autoimmune hepatitis and primary biliary cirrhosis

3 讨论

自身免疫性肝病患者前期总体表现为食欲下降、乏力、肝区不适、黄疸等，不同类型疾病也具有典型症状。自身免疫性肝炎以肝细胞病变为主，特征是血清转氨酶、免疫球蛋白水平升高；原发性胆汁性肝硬化以小叶间胆管和小胆管病变为主，特征是胆内淤胆、总胆红素升高等；原发性硬化性胆管炎以肝内大胆管病变为主，与原发性胆汁性肝硬化患者临床症状相似，需进行造影区分[1]。由于症状不明显，多数自身免疫性肝病患者就诊时已进展至肝硬化、肝衰竭或伴有溃疡性结肠炎等其他并发症，严重影响患者生存及生活质量。

微小RNA(micro RNA, miRNA)是一类能够稳定存在于细胞内具有调控功能的短链非编码RNA，能够参与疾病进展。Nakagawa等[8]研究表明，miR-425在原发性胆汁性肝硬化中表达水平显著下调，与疾病进展有关，上调miR-425表达可能作为该疾病免疫治疗策略。Zhang等[9]研究发现，乙型肝炎中miR-27a表达水平明显高于健康对照组，可作为乙型肝炎发生发展预测因子。有研究[10]报道，原发性硬化性胆管炎中miR-200b表达上调，长时间黑暗环境中下调miR-200b水平可降低肝纤维化。以上研究提示，miRNA在自身免疫性肝病及肝炎进展中有重要作用。本研究结果显示，与健康对照组相比，自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者外周血miR-21、miR-155表达水平均显著升高，提示miR-21、miR-155可能与自身免疫性肝病发生、发展有关。有研究发现，miR-21在系统性红斑狼疮中表达水平显著高于正常对照组，与疾病活动性有关[11]。Hou等[12]研究证实，溃疡性结肠炎中miR-155表达水平升高，与Th17及相关炎症因子表达上调有关。提示miR-21和miR-155可能通过免疫或炎症调控通路参与自身免疫性肝病进展。

Th17细胞是一种能分泌IL-17的T细胞亚群，与IL-6、IL-23等促炎因子分泌水平密切相关，在免疫性疾病中发挥重要作用。Tregs细胞是维持机体免疫平衡的重要因素之一，主要分泌IL-10、TGF-β等细胞因子。Feng等[13]研究表明，Th17/Tregs比值在自身免疫性肝病中表达水平明显升高，且活动期合并不良反应患者及治疗后好转患者Th17/Tregs比值明显高于缓解期合并不良反应患者及治疗后未好转患者。本研究结果显示，自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者外周血Th17细胞比例、Treg细胞比例、Th17/Treg及Th17 MFI值均明显高于健康对照组，与Feng等[13]研究结果相似。本研究还发现，自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者血清miR-21、miR-155表达水平均与外周血Th17/Treg水平呈正相关，提示miR-21、miR-155可能通过影响Th17/Treg水平参与自身免疫性肝病进展。

Ganesan等[14]在类风湿性关节炎研究中发现，IL-17可能通过调控STAT-3、IL-23等细胞因子表达参与疾病进展。有研究报道，下调IL-6表达可减轻炎症反应，抑制溃疡性结肠炎发展[15]。IL-10在狼疮性肾炎患者血清中表达水平显著升高，在疾病发展中有一定作用[16]。Wang等[17]研究表明，溃疡性结肠炎中促进TGF-β表达可抑制结肠上皮炎症。本研究结果显示，与健康对照组相比，自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者血清IL-10、IL-17、IL-23及IL-6水平均上调，TGF-β水平均下调，与类风湿性关节炎、狼疮性肾炎、溃疡性结肠炎中表达结果一致，提示IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β等细胞因子水平可能与自身免疫性肝病发生、发展有关。

进一步研究发现，自身免疫性肝炎组患者外周血miR-21表达水平与IL-10、IL-17、IL-23呈正相关，与TGF-β呈负相关；miR-155表达水平与IL-10、IL-17、IL-6呈正相关，与TGF-β呈负相关。原发性胆汁性肝硬化组患者外周血miR-21表达水平与IL-10、IL-17、IL-6呈正相关，与TGF-β呈负相关；miR-155表达水平与IL-17、IL-23呈正相关，与TGF-β呈负相关。提示miR-21、miR-155可能通过影响Th17/Treg平衡，调控IL-10、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β等细胞因子水平，促进自身免疫性肝病进展。但具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，与健康对照组相比，自身免疫性肝炎组和原发性胆汁性肝硬化组患者外周血miR-21、miR-155表达水平均显著升高，与Th17/Treg比值及相关细胞因子水平变化有关，miR-21、miR-155可能通过影响Th17/Treg平衡，促进自身免疫性肝病发生、发展。但由于本研究方法较为基础，样本量较少，具体作用机制尚需大量实验进一步研究验证。