高效液相色谱结合DA方法对3种虫草的分类研究*

于兴军，许明光，李东兴，吴 杰

（1.北华大学 林学院，吉林 吉林 132013；2.吉林省桦甸市桦树林场，吉林 吉林 132414；3.北京首诚农业发展有限公司，北京 102402；4.北京航天农业生物科技有限公司，北京102447）

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis） 隶属于线中草科（Ophiocordicipitaceae）为冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体[1]，是我国传统名贵中药，始载于《本草从新》，谓其能保肺，益肾止血，化痰止劳嗽[2]。现代药理和临床研究结果表明，冬虫夏草具有强心、降血脂、降低胆固醇、调节机体免疫力、抗肿瘤等多种药理活性，对高血压、冠心病、慢性肝炎、慢性肾炎、支气管炎以及食道癌、肝癌、自身免疫性疾病等均有较好疗效[3]。野生冬虫夏草因其独特的生长环境和近年来的过量采集，使得其产量降低、价格昂贵。据报道，蛹虫草（Cordyceps militaris） 与冬虫夏草的化学成分与药理作用相似[4-5]，因而人工培育蛹虫草在近年来被广泛研究。目前人工培养的蛹虫草主要有柞蚕蛹虫草和蛹虫草子实体2种类型。柞蚕蛹虫草是人工将蛹虫草菌接种到活的柞蚕蛹上培养而成，是蛹虫草子座与菌核两部分组成的复合体[6]；蛹虫草子实体是将蛹虫草菌接种到代料培养基上而培养出的真菌子实体[7]。

据报道，虫草中的主要活性成分为核苷类物质[8]，包括虫草素（3’-脱氧腺苷）、腺苷、尿苷、鸟苷、胸苷等，具有广泛的生理活性，是虫草品质的主要参考指标[9-10]。但目前有关冬虫夏草及人工虫草品质控制和监管的统一标准方法尚未建立，市场上的各类虫草及其制品的品质参差不齐，甚至有不良厂家在各类虫草制品中以次充好、以假乱真。因此，通过对冬虫夏草、柞蚕蛹虫草、蛹虫草子实体利用高效液相色谱对比分析其活性成分差异，结合判别分析法建立区分冬虫夏草、柞蚕蛹虫草以及蛹虫草子实体的方法，为虫草的品质控制及虫草资源的进一步开发利用提供依据。文献检索显示检测虫草中主要核苷类活性物质的方法以高效液相色谱法最为普遍[11]，但未见有用该方法对比分析3种虫草的虫草素、腺苷、尿苷、鸟苷、胸苷的报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

12个柞蚕蛹虫草样品分别来自于10个蛹虫草生产厂家，其中吉林2个（YC1～YC2）、辽宁3个（YC3～YC5）、山东 1个 （YC6）、上海 1个 （YC7）、杭州1个（YC8），北京2个厂家各提供2个批次共4个样品 （YC9～YC12）。

8个蛹虫草子实体样品分别来自于8个蛹虫草子实体生产厂家，其中辽宁2个（ZST1～ZST2）、内蒙 2个 （ZST3～ZST4）、河北 2个 （ZST5～ZST6）、山东1个（ZST7）、广东1个（ZST8）。

4个冬虫夏草样品来自于青海省玉树市称多县和西藏的巴青县、索县的农户（DCXC1～DCXC4）。

1.1.2 试剂

虫草素，纯度≥99.0%，购自北京百灵威科技有限公司；腺苷、胸苷、鸟苷、尿苷，纯度≥99.0%，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甲醇，色谱纯，购自北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Mliil-Q型超纯水仪，美国MILLI-PORE公司；KQ-500DE超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A高速离心机，上海安亭科学仪器厂；高效液相色谱仪，配DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品准备

分别将经过预冷冻的虫草样品放入冷冻干燥机内处理12 h，取出后粉碎并过60目筛，然后精确称取过筛后的样品0.50 g，置于50 mL离心管中，加入20%甲醇25 mL，于30℃、80 kHz条件下超声提取30 min，提取结束后将离心管置于20℃、5 000 r·min-1的离心机中离心10 min，吸取上清液2 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤后得到样品溶液，备用。

1.3.2 标准溶液配制

分别准确称取虫草素、腺苷、胸苷、鸟苷和尿苷标准品各0.010 0 g，置于10 mL容量瓶中，用20%甲醇溶解后定容，摇匀，作为标准品储备液。吸取适量上述各标准品溶液，分别用20%甲醇准确稀释成 2.00 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、75.00 μg·mL-1的标准溶液[12]。

1.3.3 色谱分析条件

色谱柱 （Agilent C18，250.0 mm × 4.6 mm，5.0 μm）；流速 1.0 mL·min-1；检测波长 260 nm；进样体积20 μL；柱温30℃。流动相A为超纯水，流动相B为甲醇。梯度洗脱顺序：0（5%B） →5 min（5%B） →15 min （20%B） →25 min （35%B） →30 min（35%B）。

1.4 数据处理

定性分析：将虫草素、腺苷、胸苷、鸟苷和尿苷的混合标准液进行HPLC分析。通过将样品与标准品图谱保留时间的比对，确定虫草样品中的主要活性成分。并选取3类虫草HPLC图谱的共有峰作为虫草的特征指纹峰。

定量分析：依据外标法计算3种虫草中虫草素、腺苷、胸苷、鸟苷和尿苷的含量。SPSS软件DA判别分析计算，首先选取21个样品（3个冬虫夏草、11个柞蚕蛹虫草和7个蛹虫草子实体） 的13个共有特征指纹峰数据作为判别分析样本集建立判别模型，然后依据该模型对随机3个预留样品（1个冬虫夏草、1个柞蚕蛹虫草和1个蛹虫草子实体）进行DA预测判断试验，以验证该方法的准确性。混合标准品色谱图见图1。

2 结果与分析

2.1 流动相及梯度洗脱程序的优化

冬虫夏草及柞蚕蛹虫草、蛹虫草子实体所含化学成分复杂，且各种类型的化合物的极性差别较大[13]。进行等梯度甲醇-水系统、乙腈-水系统，以及不同梯度的甲醇-水系统、乙腈-水系统洗脱，结果表明选择水（A）-甲醇（B）为流动相，洗脱程序为0（5%B） → 5 min （5%B） → 15 min （20%B） → 25 min（35%B） →30 min（35%B） 时，在30 min可以使色谱峰全部洗出，且分离较好，故选择该流动相系统及洗脱方式作为色谱条件。

2.2 虫草样品的活性成分

冬虫夏草、柞蚕蛹虫草以及蛹虫草子实体中主要活性成分含量见表1。

表1 3种虫草中主要活性成分含量Tab.1 Contents of main active components in three kinds of Cordyceps spp.

表1结果表明，柞蚕蛹虫草中核苷类含量虫草素＞腺苷＞鸟苷＞胸苷，尿苷含量低于其检测限值；蛹虫草子实体中核苷类含量虫草素＞腺苷＞胸苷，尿苷和鸟苷含量均低于其检测限值；冬虫夏草只含有一定量的尿苷、鸟苷和腺苷，不含虫草素。可以看出，柞蚕蛹虫草中的核苷类成分组成及总含量均优于冬虫夏草和蛹虫草子实体，并且其中腺苷和虫草素是3种虫草中含量较高的核苷类成分，而无论是按腺苷还是按虫草素含量排序，顺序均为柞蚕蛹虫草＞蛹虫草子实体＞冬虫夏草。

2.3 虫草指纹图谱分析

选取各个虫草样品HPLC图谱中的13个共有峰作为3种虫草的特征指纹峰，详见表2。

随机选取 3个预留样品 （DCXC1、YC5和ZST7），其余21个样品作为DA分析样本库，进行DA典型判别分析计算，得到3种虫草的DA判别分析模型，结果见图2。

由图2可以看出，不同类别的虫草所含的活性物质构成和含量有所差异，因此根据这种差异，可以将相同类别的虫草样品显著地聚在一起，而将不同类别的虫草区分开。此外，冬虫夏草与其他两类虫草区分明显，这可能是因为冬虫夏草的活性成分构成及含量与柞蚕蛹虫草、蛹虫草子实体均有较大差异。

2.4 模型验证

用2.3建立的判别模型对预留的随机选取的3个虫草样品（冬虫夏草DCXC1、柞蚕蛹虫草YC5和蛹虫草子实体ZST7）进行DA预测判断，结果见图3，其交叉验证结果见表3。

表2 3种虫草24个样品的特征峰值Tab.2 Characteristic peaks of 24 samples in three kinds of Cordyceps spp.

由图3可以看出，预留的随机选取的3个虫草样品判别分析结果分别都落在对应的本类别的判定区域中。从表3交叉验证结果可以看出，该DA判别分析模型具有良好的分类性能和较高的预测精度，说明该方法可以有效的进行这三种虫草的预测判别。

3 结论

通过高效液相色谱法分析冬虫夏草、柞蚕蛹虫草以及蛹虫草子实体中的主要核苷类活性成分和13个共有特征峰，并依据特征峰值，利用SPSS软件对其进行DA判别分析。结果表明，该方法能有效地将这三类虫草区分在不同区域，形成各自的聚集区，区分效果良好，并且对于预留的随机抽取的冬虫夏草、柞蚕蛹虫草和蛹虫草子实体样品的预测判别准确性较高，该方法可以作为3种虫草及其制品的鉴别和质量监测的有效方法。

表3 3个虫草样品判别结果Tab.3 Discriminating results of three Cordyceps spp.samples