黄芪提取物抗氧化活性研究

孙 晨，朱 辉，董德涛，孙文棋

(江苏吉贝尔药业股份有限公司，江苏 镇江 212009)

黄芪(RadixAstragali)为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，脱毒排脓，敛疮生肌等功效[1]。现代药理研究表明，黄芪具有明显的抗氧化[2-3]、抗心血管疾病[4-5]、免疫调节[6-7]、抗肿瘤[8-9]等药理活性，具有广泛的研究价值和应用前景。本研究较系统的研究了黄芪多糖及各萃取部位的抗氧化活性，并对其抗氧化能力进行比较。

1 材料

1.1 药材

黄芪，购于甘肃陇西，鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

1.2 仪器

UV-2102紫外可见分光光度计(日本岛津)；HH-S数显恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)；MP502B电子天平(上海精密科学仪器)；HC-2516高速离心机(科大创新股份)；BuchiR-200型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；ALPHA 1-2LD冷冻干燥机(德国Marin Christ公司)；RZ -6真空泵(德国VACUUBRAND公司)；试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 黄芪多糖的制备

将过药典2号筛的干燥黄芪粉末适量，加入6倍于药材质量纯化水，水浴回流提取2次，每次2 h，合并滤液并减压浓缩，得黄芪水提物。取水提物适量，加4倍量95%乙醇，静置过夜，离心得上清液和醇沉粗多糖。通过sevage法去除粗多糖中蛋白成分，按照粗V(多糖)∶V(氯仿)∶V(正丁醇)=100∶20∶4比例加入氯仿、正丁醇剧烈振遥15min，离心15min，混合液分层，上层为多糖水溶液，取上清后，再按上述方法重复5次，将最后所得上清，加入活性炭超声并过滤，冷冻干燥得黄芪多糖。苯酚-硫酸法测得多糖纯度为68.3%。

2.2 黄芪水提物不同极性部位的制备

将2.1中醇沉上清液减压浓缩，得黄芪水溶液。将其转入分液漏斗中，加入相同体积的乙酸乙酯，轻轻振摇，静置，待溶液完全分层后，放出下层水溶液，收集乙酸乙酯部分；同法再萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩后冷冻干燥，得黄芪水溶液的乙酸乙酯部位。剩余水溶液继续用正丁醇萃取，正丁醇和剩余水溶液减压浓缩，浓缩液冷冻干燥，得正丁醇部位及剩余水部位。

2.3 供试品溶液的制备

分别精密称取黄芪多糖、黄芪乙酸乙酯部位、黄芪正丁醇部位及剩余水部位物质各25 mg，用去离子水定容至25 mL，乙酸乙酯部位用60%乙醇定容至25ml，得1 mg/mL的供试品溶液，备用。

2.4 阳性对照药溶液的制备

精密称取抗坏血酸25mg，用去离子水定容至25 mL，得1 mg/mL的阳性对照药溶液，备用。

2.5 DPPH自由基清除能力测定

本实验参照余以刚等[10]的实验方法，略有改进。分别取黄芪各部位待测液100,200,400,600,800μL于具塞试管中，各自补充蒸馏水至1 mL，加入去离子水溶液2mL，0.1mmo1/L DPPH溶液(精密称取4mgDPPH，用无水乙醇定容至50mL)1mL ，摇匀，黑暗处静置30min。用去离子水调零，测定517nm处的吸光度A样品。测定1mL不同浓度的样品溶液与3mL 去离子水混合液在517nm处的吸光度A对照，再测定1mL DPPH溶液与3mL 去离子水在517nm处的吸光度A空白。DPPH清除率=[A空白-(A样品-A 对照)/A空白]×100%。

2.6 总抗氧化能力的测定

参照Prieto等[12]的方法略作修改。分别取黄芪各部位待测液100、200、400、600、800μL于具塞试管中，各自补充去离子水至1 mL，各加3 mL混合液(精密称取磷酸钠1.065 g，钼酸铵0.494 g，用少量去离子水溶解后加浓硫酸3.28 mL，定容于100 mL容量瓶中得)，加塞于95℃水浴中加热90 min，取出后冷却至室温，用去离子水调零，在695 nm处测定吸光度。

2.7 邻二氮菲-Fe3+法测定抗氧化能力

本实验参照刘薇等[13]的实验方法并略有改进。分别取黄芪各部位待测液100、200、400、600、800μL于10mL容量瓶中，各自补充蒸馏水至1 mL，加入1 mL 0.2%氯化高铁溶液，500 μL 0.5%邻二氮菲，用60%乙醇定容至10 mL，暗处放置20 min，在510 nm处测定吸光度，用60%乙醇调零。

3 结果与讨论

3.1 黄芪各部位清除DPPH能力

由图1可知，黄芪多糖、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、剩余水部位对DPPH均具有清除能力，且随着浓度增大，清除能力逐渐增强。以IC50作为评价指标，IC50值越小，抗氧化剂清除自由基的能力越强[15]。由表1可知，黄芪正丁醇部位和多糖清除DPPH自由基的能力相对较强。

表1 黄芪各部位清除DPPH的IC50Tab 1 IC50Value of Scavenging DPPH free radicals activities of astragalus

图1 黄芪各部位清除DPPH能力比较Fig.1 Scavenging activities of each fraction of astragalus on DPPH free radicals

3.2 黄芪各部位总抗氧化能力

由图3可知，黄芪多糖及各萃取部位总抗氧化能力：剩余部位>乙酸乙酯部位>乙醇提取物部位>二氯甲烷部位>石油醚部位。在相同的浓度下，剩余部位的总抗氧化性能仅次于Vc。

图2 黄芪各部位总抗氧化能力比较Fig.2 Comparison of total antioxidant activities of each fraction of astragalus

3.3 邻二氮菲-Fe3+法测定抗氧化能力

本实验采用邻二氮菲-Fe3+法测定黄芪多糖及各萃取部位抗氧化能力，使抗氧化成分直接与反应体系中的Fe3+作用，避开额外产生自由基的影响，提高方法的精密度。由图4可知，黄芪多糖与黄芪正丁醇部位有较强的抗氧化能力。

图3 邻二氮菲-Fe2+法评价黄芪各部位抗氧化能力Fig.3 Comparison of anti-oxidant activity each fraction of astragalus by phenanthroline-ferric ion of assay

综合发现，黄芪多糖、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、剩余水部位抗氧化活性具有较明显的差异，正丁醇部位和多糖具有较强的抗氧化活性。同时发现，不同方法之间测得的抗氧化活性基本一致，但研究表明有些体系证明抗氧化活性优于Vc，有些体系证明抗氧化活性次于Vc。因此，不能仅凭一种方法就断定某种成分或部位具有强抗氧化活性，须将多种原理的方法结合起来，才能较为准确的评价药物抗氧化活性强弱。